鸭传染性浆膜炎检测技术研究进展

刘 伟黄 瑜

（1.福建农林大学动物科学学院 福州 350000；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013）

鸭传染性浆膜炎最早发现于美国的纽约，其后在英国、加拿大等国发生，我国于1982年首次报道该病的存在，是危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。临诊表现为困倦，眼与鼻孔有分泌物，排白色黏稠样粪便，神经症状如共济失调、抽搐、头颈震颤等，慢性病例可见斜颈。病理变化特点为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。临诊中该病易与鸭大肠杆菌病混淆，建立快速、及时、准确的检测方法具有重要意义，有助于治疗药物的选择，减少经济损失。本文就鸭传染性浆膜炎检测技术的发展进行综述。

1 传统的鸭传染性浆膜炎检测方法

1.1 病原的分离鉴定 初次分离时无菌采取病死鸭心血、肝脏或脑组织，在巧克力培养基和胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上划线，在含有二氧化碳的环境中培养，平板上会长出表面光滑的菌落，稍突起，圆形，直径1～1.5 mm，若继续培养菌落可达2 mm。鸭疫里默氏菌不能在普通琼脂和麦康凯培养基上生长，在血琼脂上不产生溶血。该菌革兰氏染色为阴性小杆菌，无芽孢，有荚膜，瑞氏染色为两极浓染。

细菌的分离鉴定需要时间较长，一般为2～3 d，并且费时费力，不适于常规的临床诊断，也不适合于大规模集约化生产中鸭疫里默氏菌病的检测。

1.2 生化试验 该菌不发酵碳水化合物，但少数菌株能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖或肌醇，不产生吲哚和硫化氢，不还原硝酸盐，不产生靛基质和硫化氢，可液化明胶，接触酶试验和尿素酶分解皆为阳性，西檬氏枸杞酸盐利用阴性，氧化酶、过氧化氢酶、磷酸酶阳性。

1.3 血清学检测方法

1.3.1 平板凝集试验 将阳性血清（适当稀释）与待检菌悬液各一滴滴在玻片上混合，数分钟后，出现颗粒状或絮状沉淀者为阳性。该试验用于鸭疫里默氏菌的血清型初步鉴定，操作简便快速。但敏感性较低，还有可能发生不同血清型间的交叉反应。

1.3.2 试管凝集试验 用来检测血清中是否存在相应抗体，测定抗体的效价，也用于对玻片凝集试验中表现交叉反应的分离株进行进一步的检测以及明确各型标准菌株之间的抗原关系［1］。操作简单快速，敏感性较低。

1.3.3 间接血凝试验 高福等［2］报道了用琼脂扩散抗原致敏戊二醛化的绵羊红血球来检测血清中RA抗体，初步证明其敏感性较高。

1.4 琼脂凝胶扩散试验 利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行反应，当抗原抗体分子相遇并达到相应比例时，就会相互结合，凝集，出现白色的沉淀线，从而判定相应的抗原和抗体。该试验用于鸭疫里默氏菌的血清型初步鉴定，敏感性也较低。

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测抗体常用的方法之一，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，相对于凝集试验和沉淀试验，ELISA具有更高的敏感性，从而适合于对血清中的RA抗体效价进行检测［1］。

Hatfie1d等（1987）建立了用ELISA方法来检测鸭血清中抗RA抗体，但其抗原为2型RA的裂解菌体，并且应用了酶标记驴抗兔IgG，操作步骤和试验结果判定都较为复杂。

张鹤晓等［3］用裂解的1型RA菌体作为包被抗原，建立了特异性强，重复性良好且敏感性高的检测鸭血清中RA1型抗体的ELISA方法。该方法可作为鸭传染性浆膜炎感染的血清流行病学调查和对其疫苗免疫效果评价。方法如下：制备RA抗原，自制阳性血清和阴性血清，酶标兔抗鸭IgG的制备，底物溶液的配制，洗涤液中NaC1浓度对非特异性吸附影响的测定，进行ELISA。

苏敬良等［4］、程龙飞等［5］、程安春等［6］又分别建立了检测2型、3型、4型RA抗体的ELISA方法。Huang等［7］以 RA15型的OmpA 基因（P45）编码 N-端的41 ku蛋白的编码区进行重组表达的蛋白建立间接ELISA方法，可以对多种RA的早期感染进行有效的检测。辜新贵等［8］根据克隆的RA1型的一种“保守的假定蛋白（conserved hypothetica1protein）”基因（ P25）（ GenBank Accessio No：EU072443）进行重组表达，建立以重组P25蛋白为包被抗原的间接ELISA。P25蛋白是各种血清型RA间的共同抗原，所建立的ELISA可用于检测不同血清型RA的感染。

1.6 免疫荧光技术 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。该技术具有简便、快速、敏感和特异性强等特点。检测时取病料涂片、固定、然后进行特异荧光染色、最后镜检，荧光着染的RA在黑暗的背景中呈椭圆形亮黄绿色环状结构，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌均不被荧光着染，整个视野暗淡、只隐约见到灰暗色的菌体［1］。该检测方法快速、准确的区分大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌。Marshe11最早报道了用该技术检查患鸭组织或渗出物中的RA［1］。

免疫荧光技术检测鸭疫里默氏菌病可分为直接荧光抗体技术和间接荧光抗体技术。郭玉璞等采用直接荧光抗体法来诊断急性病例。苏敬良等［9］将间接荧光抗体技术用于急性死亡病例的检测。朱琪等建立了间接免疫荧光抗体试验，对鸭疫里默氏菌病等进行鉴别。张大丙等［1］的研究结果表明，直接和间接荧光抗体试验均无型特异性，却均有种特异性，因此，都可用于菌种的鉴定，但在两种试验中，都以同型抗原抗体之间出现较强的荧光，而异型之间出现的荧光易衰减［1］。

2 分子生物学检测方法

分子生物学检测相对于传统的检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速等优点。

2.1 PCR技术 PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95℃时解旋，35℃时引物与单链按碱基互补配对结合，再调温度至65℃左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。RA的血清型十分复杂，目前全世界已报道的血清型有21个，不同血清型之间没有交叉保护作用。由于PCR方法并不针对病原菌的血清型，因此，能够弥补血清型之间交叉反应性低或没有交叉反应性的不足［10］。

胡清海等首先建立了PCR检测鸭疫里默氏菌病的方法［11］。杨建远等［12］设计了特异性引物，建立了鸭疫里默氏菌病的快速准确的PCR检测方法。其研究根据GenBank中25株鸭疫里默氏菌（RA）的外膜蛋A（OmpA）基因序列，在其高度保守区设计了一对特异性引物，该PCR检测方法具有准确、可靠、快速、经济之优点，可用于RA的临床检测和流行病学调查。曲丰发等［13］以16SrDNA为靶基因建立特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌的方法具有较好的特异性和敏感性。覃宗华等［14］采用细菌16SrRNA基因的通用引物，用PCR方法扩增出鸭疫里默氏菌的部分16SrRNA基因，同时利用生物软件对Gen－Bank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌16SrRNA基因序列进行分析后，设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物，并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病的双重PCR方法。

PCR检测除16SrRNA基因序列分析法和外膜蛋白分析法外，还有RFLP和REP-PCR分析法。

2.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术（Rea1-Time Quantitative PCR）是近年发展起来的一种高敏感性检测技术，它在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术放大检测了信号，提高了检测的敏感性；荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高；荧光定量PCR结果相当稳定，无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性，假阳性结果几率降低。荧光定量PCR分DNA荧光结合染料法和特异性荧光探针法，荧光探针法特异性较高。

段泽等［15］根据其实验室发现的鸭疫里默氏菌（RA）荚膜多糖蛋白基因序（DQ151838），设计和合成荧光定量PCR引物和探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。可用于鸭疫里默氏菌感染的快速诊断、流行病学调查和鸭产品的检疫等。

谢永平等［16］的研究根据GenBank登录的鸭疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守区序列，设计引物和探针，建立了直接检测鸭疫里默氏菌的实时荧光定PCR快速方法。该方法应用热裂解法快速提取病料中RA中的DNA，与常规试剂提取方法比较，仅需30 min，缩短了DNA提取时间，应用建立的实时荧光定量PCR检测临床样品，完成检测仅需2 h，与试剂提取DNA方法需要5 h比较，显著缩短了检测周期，为临床诊断RA提供了快速检测方法，适用于临床鸭疫里默氏菌病的快速检测。

冯金牛等［17］根据RA的16SrRNA基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该方法只对RA的DNA有阳性扩增信号，对 E.coli、P.multocida、Salmonella均无特异性反应。所建立的FQ-PCR方法具有良好的稳定性和重复性，标准曲线相对理想，具有较好的实用性，所建立方法的敏感性和特异性均高于普通PCR，且省时省力。

3 小结

鸭疫里默氏菌病是目前我国危害养鸭业最重要的传染病之一，使我国养鸭户遭受重大的经济损失，严重阻碍了中国养鸭业的发展。以上是鸭疫里默氏菌病的检测方法，各有特点，希望以后能有更多更好的检测方法应用于鸭疫里默氏菌病的检测之中。

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