川芎嗪抑制大鼠颈动脉球囊损伤后再狭窄的在体研究

华军益 何煜舟 蒋旭宏 叶武 潘智敏

川芎嗪抑制大鼠颈动脉球囊损伤后再狭窄的在体研究

华军益 何煜舟 蒋旭宏 叶武 潘智敏

目的 研究川芎嗪对大鼠颈动脉球囊损伤后再狭窄的影响及机制。 方法 建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型，分为假手术组、模型组和川芎嗪组。川芎嗪组为川芎嗪[10mg（kg·d）]尾静脉预给药1周，球囊成形术后继续同剂量川芎嗪尾静脉注射6周。于第6周末收集损伤段颈动脉，病理切片HE染色测量内中膜厚度比及Western blot检测相关蛋白表达水平。 结果 大鼠颈动脉球囊损伤后6周，损伤段血管内膜明显增厚，模型组和川芎嗪组与假手术组比较，内膜/中膜面积比显著增加（P＜0．05）；与模型组比较，川芎嗪组内膜/中膜面积比下降（P＜0．05）。模型组损伤段血管Wnt 4、Dvl-1、β-catenin、Cyclin-D1表达表达水平较假手术组显著增高，而川芎嗪组的表达明显减少（均P＜0．05）。 结论 川芎嗪可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后再狭窄，其机制与下调Wnt信号通路有关。

川芎嗪 Wnt信号通路 血管再狭窄 血管内膜

冠状动脉支架术后血管再狭窄一直是影响介入治疗效果的主要因素，深入研究血管再狭窄的病理机制和开发有效预防再狭窄的药物具有现实意义。目前认为，血管中膜平滑肌细胞增殖、迁移和胶原大量合成导致内膜增厚是血管再狭窄的主要病理改变[1-4]。笔者前期研究发现中、高浓度的川芎嗪能够显著抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和胶原合成，其机制与下调Wnt4/Dvl-1/β-catenin信号通路有关[5]。本实验通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，进一步研究川芎嗪抑制动脉再狭窄的作用并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料、仪器和试剂

1.1.1 实验动物及分组 SPF级SD大鼠24只，雌雄不限，体重350～400g，购自浙江中医药大学动物实验中心，普通饲料喂养，自由进食、饮水，室温20～24℃，自然采光，动物喂养、手术和取材均在动物实验中心完成。以随机数字表法分为3组，每组8只：（1）假手术组：仅进行右颈动脉分离和结扎，局部皮肤缝合，不给予球囊成形术及任何处理；（2）模型组：予球囊成形术，术后通过灌胃器给予等容积0.9%氯化钠注射液6周；（3）川芎嗪组：术前予尾静脉给药1周10mg/（kg·d），球囊成形术后继续同剂量川芎嗪尾静脉注射6周。

1.1.2 主要实验仪器和试剂 显微手术器械为上海医疗器械有限公司手术器械厂产品，动物手术操作台、Endeavor sprinter 1.5×12mm PTCA球囊扩张导管为美国Medtronics公司产品，莱卡DM2500正置显微镜和LAS 3.8图像拍摄系统为德国Leica公司产品。兔抗鼠βcatenin单克隆抗体购于美国Epitomics公司，兔抗鼠DVL-1抗体、Wnt 4抗体及Cyclin-D1抗体购于美国Bioss公司，兔抗鼠β-tubulin抗体购于美国Proteintech公司，HRP标记的羊抗兔IgG二抗购于美国Santa Cruz公司，琼脂糖、RNA酶购于上海Sangon公司，川芎嗪冻干粉为哈尔滨三联药业产品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠颈动脉球囊损伤的模型的建立 川芎嗪组大鼠术前1周每天尾静脉推注川芎嗪注射液10mg/kg，第8天行球囊成形术。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/ kg，麻醉后取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素100U/kg，在右侧气管旁寻找到右颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，行钝性分离。于右总颈动脉近心端用血管夹暂时阻断血流，从颈外动脉处切开动脉，将1.5mm× 12mm PTCA球囊导管从切口仔细轻柔插入至颈总动脉约2.0cm，助手用压力注射泵以5atm打开球囊，回抽球囊以剥脱内膜，如此反复5次。将导管撤出后，结扎颈外动脉，恢复血流，缝合伤口。术后保暖复苏后大鼠继续在实验动物中心普通饮食饲养，术后继续同剂量川芎嗪尾静脉注射6周。模型组大鼠只予球囊成形术，术后予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃6周。假手术组过程同上，仅在颈外动脉切开后不插入球囊导管进行损伤内膜操作。

术后第6周末处死各组大鼠，腹腔注射过量的戊巴比妥钠，开腹剪破腹主动脉放血后，取出损伤部位的左颈总动脉约1.0cm并分为两段，一段用无水甲醛固定1～2d，石蜡包埋后行病理切片，HE染色后在光镜下观察血管内膜增生情况，每份标本非连续取4处切片；另一段立即存入液氮罐冻存，再放置-80℃保存待行Western blot检测。

1.2.2 大鼠颈动脉内膜增生的检测 各标本经梯度乙醇脱水、透明、包埋后切片，行HE染色后在光镜下观察VSMC的形态及内膜增生情况，采用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件测定血管内膜和中膜面积，并计算内膜和中膜面积比。采用Image Pro Plus软件进行图像分析，计算管腔面积、内外弹力板围绕面积，内膜和中膜厚度。，中。新生内膜面积=内弹力板围绕面积-管腔面积。每只大鼠随机取3张切片，每张切片测量3次，取平均值。

1.2.3 Western blot法检测Wnt信号通路各蛋白表达提取细胞总蛋白，上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后用凝胶图像分析软件对膜片扫描测定区带的感光密度，蛋白表达水平用目的片段与内参β-tubulin的光密度比值（%）表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料以表示，方差齐者，两组间的比较采用t检验，多组资料之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。

2 结果

2.1 大鼠颈动脉球囊损伤模型 本实验共24只大鼠，假手术组8只全部存活，模型组存活6只，川芎嗪组存活6只，模型制作成功率为75%。

2.2 大鼠颈动脉损伤处的病理改变

2.2.1 病理形态学改变 大鼠颈动脉球囊损伤后6周，HE染色后镜下观察提示模型组颈动脉内膜出现明显增厚，新生内膜突向管腔，细胞与纤维排列均不规则，部分内弹力板严重破坏，细胞外基质沉积。与模型组相比，川芎嗪组的病理改变明显减轻，内外弹力板保存相对较完整，见插页图1。

图1 颈动脉球囊成形术后大鼠动脉损伤处的病理改变（A：假手术组，HE染色，×40；B：假手术组，HE染色，×200；C：模型组，HE染色，×40；D：模型组，HE染色，×200；E：川芎嗪组，HE染色，×40；F：川芎嗪组，HE染色，×200；箭头所示为颈动脉内、外弹力板）

2.2.2 术后6周各组大鼠颈动脉内膜增生情况 术后6周，模型组内膜厚度、新生内膜面积和内膜/中膜面积比均高于假手术组，而川芎嗪组的内膜厚度、新生内膜面积及内膜/中膜面积比均低于模型组（均P＜0.05），见表1。

表1 术后6周各组颈动脉内膜增生情况

2.3 术后6周各组大鼠颈动脉损伤处相关蛋白表达 与假手术组比较，模型组Wnt信号分子表达增加，川芎嗪组的相应蛋白表达下降（P＜0.05），见图2及表2。

图2 各组大鼠颈动脉损伤处相关蛋白表达

表2 各组相关基因的蛋白表达

3 讨论

笔者前期体外实验提示Wnt信号通路激活可以促进VSMC增殖和合成胶原[5]，但这是在体外用VSMC株并由AngⅡ诱导而产生的情况。而在体环境情况要复杂得多，作为效应细胞的VSMC受到体内外各种复杂因素影响，是体外培养条件下无法模拟的，并有可能产生不同的结果，因此体外实验结果还不能推导在体实际情况，需要在体实验进一步证实。

目前大多数学者认为经皮冠状动脉成形术（PTCA）后再狭窄是由于动脉中膜平滑肌增生、迁移并分泌大量细胞外基质形成增厚的新生内膜造成[1-4]。大鼠颈动脉球囊损伤后2周发现新生内膜形成，主要有增殖的平滑肌细胞（HE染色），排列紊乱结构不完整，内膜面粗糙，内弹力板断裂，6周时新生内膜增厚明显，部分平滑肌细胞增大、排列紊乱，提示其可能是具备增殖、迁移、合成细胞外基质能力的合成表型的VSMC，表明球囊损伤后大鼠颈动脉发生了再狭窄的病理形态学改变[6-7]。川芎嗪干预的大鼠颈动脉增厚不明显，提示川芎嗪可以抑制球囊损伤后血管内膜的增厚，对血管再狭窄防治有疗效。值得一提的是，在建立大鼠动脉损伤模型时，为了更好地模拟临床PTCA对冠状动脉损伤的真实场景，笔者仅作球囊扩张并拉动损伤颈动脉，不附加高脂饮食（冠心病患者PCI手术后往往强调低脂饮食和他汀治疗）。

通过检测损伤段血管的Wnt信号分子蛋白表达，发现损伤段颈动脉的Wnt4/Dvl-1/β-catenin/Cyclin-D1表达明显增多，川芎嗪干预可以减少损伤段血管Wnt4/ Dvl-1/β-catenin的表达，同时减轻了血管内膜增厚。结合体外细胞实验结果，笔者认为，尽管在体内受到多重因子的复杂作用，VSMC的Wnt信号通路也发生明显上调，并参与了血管损伤后再狭窄的病理过程，即平滑肌细胞增殖，而川芎嗪抑制大鼠颈动脉损伤后内膜增厚与下调Wnt信号通路有关。静止状态细胞不表达Cyclin-D1，当细胞受到生长因子等刺激时表达Cyclin-D1，促进细胞进入增殖状态。Cyclin-D1是Wnt通路下游靶基因，笔者的体外实验发现，＞40μmol/L的川芎嗪可以抑制AngⅡ诱导的Wnt信号分子和Cyclin-D1高表达，在体实验中，川芎嗪组颈动脉Wnt信号分子和Cyclin-D1表达均下降，Cyclin-D1的变化进一步支持川芎嗪在体内通过下调Wnt信号通路抑制动脉内膜增生[5]。

川芎，原名芎藭，为伞形科蒿木鼠植物的根茎，常用于活血行气，祛风止痛。而TMP是从中药川芎中分离提纯的有效成分,其化学结构为四甲基吡嗪。广泛用于高血压病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注损伤降低血压、降低肺动脉高压以及抑制VSMC增殖等多种心血管药理作用[8]。有临床研究证明，川芎嗪可以防治冠状动脉支架介入术后再狭窄作用[9]。也有研究认为川芎嗪能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖，可能是通过降低钙调蛋白（CaM）和钙调神经磷酸酶（CaN）活性的而实现[10]，还有动物实验表明川芎嗪可减轻大鼠内皮损伤后内膜的增生，其作用机制与降低纤维细胞生长因子（FGF）和c-myc的表达有关[11]。也因此被笔者选择用来探讨其抑制血管再狭窄作用。而本实验进一步在在体水平证实了川芎嗪可以通过下调Wnt通路抑制血管内膜增厚，并得到了动脉组织病理形态学证实。

综上所述，Wnt信号经典通路参与调控了血管再狭窄病理过程，有望成为抗血管再狭窄新的治疗靶点；川芎嗪抑制血管再狭窄至少部分是通过下调Wnt信号通路实现的。

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Tetramethylpyrazine prevents balloon-injured carotid artery from restenosis in rats

Objective To investigate the preventive effect of tetramethylpyrazine (TMP)on balloon-injured rat carotid artery from restenosis．Methods Balloon-injured carotid artery model was established in SD rats．SD rats were divided into 3 groups:sham operation group(n=8);model group(n=8)and TMP group(n=8)．In TMP group,rats were pretreated with caudal vein injection of TMP(10mg/kg·d)for 1 week,and the same dose of TMP was continued for 6 weeks after balloon angioplasty．Injured segments of carotid artery were harvested at 6th week and embedded in paraffin wax to assess the size of intimal lesions by HE staining．Proteins expressions of Wnt4,Dvl-1,β-catenin and Cyclin-D1 were detected by Western blotting method．Results Six weeks after balloon injured,the intimal of injured artery became thickening．The ratio of intima/tunica media thickness and collagen volume in intima increased significantly compared to those of sham operation group(P＜0．05)．Compared to model group, the ratio of intima/tunica media thickness in TMP group reduced significantly(P＜0．05)．The expressions of Wnt4,Dvl-1, β-catenin and Cyclin-D1 proteins in model group increased significantly in comparison with sham operation group,while decreased in comparison with TMP group． Conclusion TMP can inhibit restenosis of balloon-injured carotid artery possibly through down-regulation of wnt signal pathway．

Tetramethylpyrazine Wnt signal pathway Restenosis Intima

2013-07-26）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省医药卫生科技计划项目（2010KWA155）；浙江省中医药科学研究基金项目（2011ZA027）

310006 杭州，浙江省中医院心内科（华军益、何煜舟、蒋旭宏、叶武），干部科（潘智敏）

华军益，E-mail:huajunyi1973@163.com