猪肺炎支原体的免疫原蛋白及疫苗的研究进展*

崔娟娟，郝秀静，张斯民，侯玉婷，李 敏

(宁夏大学 生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川750021)

猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS) 又称猪喘气病,是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道传染病，以接触性、高传染性、高发病率和低死亡率著称，普遍存在于世界各地。该病一旦爆发便难以控制，给养猪业造成了巨大的经济损失。为了解决猪肺炎支原体对养猪业造成的危害，很多国家的兽医工作者及相关研究人员对疫苗做了大量研究。猪支原体肺炎灭活疫苗自20世纪90年代在美国注册后，大量研究已经证实了支原体疫苗给养猪业带来的经济效益。目前，猪支原体肺炎疫苗仍被德国列入标准的免疫程序内。本文从猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白和疫苗研究两方面对猪肺炎支原体的免疫学研究做一综述，从而为猪肺炎支原体致病机理的进一步研究及该病的防治提供新思路。

1 猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白

猪肺炎支原体主要有下几种免疫原：细胞质蛋白(胞内具乳酸脱氢酶活性的蛋白p36)、膜蛋白(p46、p65和 p74)、粘附因子(主要为p97、p102、p216、p159、p116、Mhp107、Mhp271七种蛋白)以及核苷酸还原酶。

1.1 细胞质蛋白

p36蛋白具有很强的保守性[1]。Strasser等[3]研究显示，p36蛋白基因在猪肺炎支原体分离菌株中具有很强的保守性而且特异，其具有L乳酸脱氢酶(LDH)活性，并能引起感染猪的早期免疫反应。另有研究报道，p36蛋白与细菌的LDH同源性很高，并由单顺反子所编码。Caron等[1]发现，p36重组蛋白在对照组与试验组中猪血清中的抗体变化与临床病理变化之间找不到必然的联系，但换用其单克隆抗体却可以检测到猪肺炎支原体。祝永琴等[2]通过猪肺炎支原体p36基因在毕赤酵母中的表达研究表明p36蛋白基因在毕赤酵母中获得表达，而且其反应原性是相当不错的。这一研究结果为今后更好的研制基因工程疫苗奠定了基础。

1.2 膜蛋白

目前报道了三种具免疫优势的膜蛋白:p46、p65和p74。

1.2.1 p46蛋白 p46蛋白也具种属特异性。Cheikh Saad Bouh等[4]研究证实p46和p65两蛋白在种间的保守性和特异性均很高。Frey等[5]制备p46蛋白的单克隆抗体来检测猪肺炎支原体，并取得良好的检测效果。迟灵芝等[6]报道，已成功将猪肺炎支原体p46基因中编码Trp的密码子TGA定点突变为TGG，这将为p46蛋白基因的进一步研究及猪肺炎支原体抗体的检测奠定了基础。

1.2.2 p65蛋白 据报道，p65蛋白是Mhp的一个重要免疫原，C端是其主要的抗原表位区，p65蛋白可诱发早期的免疫应答。Cheikh Saad Bouh等[4]报道了p65蛋白的种间保守性和特异性很高。Sehmidt等[7]报道，p65蛋白除了是Mhp关键的具免疫原性的膜蛋白之外，它还是一种解脂酶。如若使p65蛋白在大肠杆菌中成功表达，必须将其序列中的l个TGA密码子进行定点突变。

1.2.3 p74 蛋白 有研究表明，p74蛋白除了是Mhp高度保守而特异的膜蛋白之外，还是一种热休克蛋白。目前，只是初步研究了采用其单克隆抗体建立的阻断ELISA的检测方法，对于其它方面还有待于进一步的研究。

1.3 核苷酸还原酶[8]

Fagan等发现了一个跟原核生物NrdF的R2亚基C末端具同源性与Mhp高免血清反应的克隆片段，将该片段克隆到沙门氏菌表达系统中，可检测到分子量大小为15 kD的一个杂合蛋白，而且其抗血清对Mhp的生长具抑制作用。将其制备的活疫苗通过口服免疫小鼠后，可在小鼠体内检测到肺部粘膜分泌的IgG和lgA与血清中抗重组NrdF都呈现明显的上升趋势。还发现只用杂合蛋白去免疫小鼠，结果检测到的IgG量没有注射重组蛋白的多。后来，Austen Y Chen等在不同的沙门氏菌表达系统中表达插入的NrdF并比较分析了其免疫效果，虽然都出现了细胞免疫，但其效果因在表达系统中所用到的载体不同而各异。

1.4 粘附因子[9]

猪肺炎支原体与呼吸道的特异性粘附是引起猪支原体肺炎的首要条件。猪肺炎支原体对猪呼吸道的黏附是多个黏附因子共同作用所致，但其黏附机制还不是很清楚。目前，已报道了多个黏附因子，本文主要对以下几个粘附因子做一总结。

1.4.1 p97蛋白 p97蛋白是最早也是目前研究较为透彻的一个黏附因子。

有研究显示， p97的C端是其主要的黏附区域，该区域包括R1和R2两个重复序列，而且构成R1和R2的重复单元是不同的，所以其黏附能力也表现出了差异。

Cheryl等[10]在体外对p97蛋白进行了分段表达，发现p97N端蛋白和C端蛋白都能与肝磷脂黏附。分别对位于C端蛋白的R1和R2区分别进行表达，发现R1和R2区对肝磷脂的黏附都是不可缺少的。

Faust等[11]研究发现，免疫组猪的肺部病变较未免疫组的有所降低且猪群日增重有所增加。还发现，商品化的疫苗比p97亚单位疫苗产生更全面的免疫保护。这暗示：除p97蛋白外，在猪肺炎支原体中可能还存在着其它的毒力因子或抗原。

1.4.2 p102蛋白 Minion等[12]的研究相继表明，在p97基因下游不到30 bp出有一个可编码约102 kDa蛋白的ORF，根据该蛋白的大小将其命名为p102。经序列分析发现，p102基因约占基因组全序列的13%，而且至少有4个拷贝。Adams等[13]研究了p97蛋白和p102蛋白及其旁系同源类似物在体内的表达情况，得出：p97和p102两蛋白以及它们的旁系基因竟位于同一转录区，而且在被感染的宿主体内都检测到了这两种蛋白。有研究推测，p102蛋白对p97蛋白的黏附具有辅助功能，而且其自身可能也具潜在的吸附纤毛的能力，当然，这仅仅是一个推测，还需进一步的验证。郭丹等[14]成功制备了具有免疫优势的p102蛋白，这一成果为研制新一代疫苗奠定了良好的基础。

1.4.3 p159蛋白 Tracey等[15]发现p159蛋白也是猪肺炎支原体表面的一种黏附因子， 该蛋白一经表达后，便裂解为110、52、27 kDa三种蛋白，这三种蛋白在各个生长阶段的Mhp表面都可检测到。其中，p52蛋白在猪肺炎支原体的不同菌株中是相对保守的，其位于p159蛋白C末端区域；据报道，抗p52的蛋白血清能够减弱猪肺炎支原体对真核细胞的黏附，这说明了p159蛋白在黏附真核细胞过程中，p52蛋白扮演了重要角色。曹培丽等[16](2009)报道了p52蛋白能与猪肺炎支原体阳性血清发生特异性反应，由此说明p52蛋白有相当不错的反应原性；p52蛋白是p159蛋白中的关键水解蛋白。对于p27蛋白而言，只知道它存在于p159蛋白的N端，具体功能还未见报道。另有研究表明，对于处于自然结构的p110蛋白，它能够阻止猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞提取物的黏附。

1.4.4 p216蛋白 Jody等[17]发现了由Mhp 493编码的一个p97蛋白的同源类似物，并将该同源类似物命名为p216蛋白。该蛋白可裂解为120和85 kDa的两种蛋白，这两种蛋白都是能与肝磷脂结合的蛋白质。经胰酶消化试验证实了这两种蛋白都存在于细胞表面。他们对p216蛋白在体外进行分段表达试验结果中得出：蛋白的每段都能粘附并进入PK15细胞。p216蛋白是目前报道的唯一一个无R1纤毛结合区却可以与肝磷脂结合的蛋白。

1.4.5 p116蛋白 Lisa等[18]也发现了由Mhp108编码的一个p102蛋白的同源类似物，该同源类似物便是p116蛋白。在p102蛋白家族中，p116蛋白也是第一个发现的能够黏附猪呼吸道和pK15细胞的黏附因子。而且p116蛋白也是首次报道的可与纤溶酶原相结合的黏附因子。据报道，p116蛋白是猪肺炎支原体关键的黏附因子和毒力因子，这为猪肺炎支原体的致病机理提供了有力的依据。

1.4.6 Mhp271蛋白 Ania等[19]报道了p97蛋白的另一个同源类似物，即Mhp271蛋白，其分子量大小约为118 kDa。Mhp271蛋白是目前报道的包括p97蛋白在内的，具有R1和R2两个区域的蛋白。为了探究Mhp271蛋白的功能，有关研究显示：猪肺炎支原体黏附过程中，Mhp271蛋白的R1区和R2区都是不可或缺的。

1.4.7 Mhp107蛋白 Lisa等[20]发现继Jody、Ania等报道后第三个p97蛋白的同源类似物，即Mhp107蛋白。Lisa等人的研究显示：Mhp107蛋白存在于细胞膜；可以与纤溶酶原、纤连蛋白和肝磷脂相结合发挥其功能；能够黏附PK15细胞和猪的呼吸道。这意味着Mhp107蛋白是多功能的，而且还是猪肺炎支原体的一个关键的毒力因子和黏附因子。

根据上述7种主要黏附因子的介绍，可总结出：(1) p116蛋白和Mhp107蛋白可作为今后亚单位疫苗的候选者。(2)p116、Mhp271和Mhp107三种蛋白黏附宿主细胞的特性为猪肺炎支原体感染宿主细胞的粘附机理提供了可参考的价值[21-22]。除此之外，也为其他病原微生物黏附至细胞外基质上的纤连蛋白提供了依据[20]。(3)具有肝磷脂黏附区域的四种黏附因子(p97、p159、p216、Mhp271和Mhp107蛋白)对细胞的黏附表明：猪肺炎支原体在黏附过程中，肝磷脂扮演了重要角色，这也为研究致病机制及制备猪肺炎支原体疫苗提供了新思路。

2 猪肺炎支原体疫苗的研究

目前报道的猪肺炎支原体疫苗主要有：灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2.1 灭活疫苗

猪支原体肺炎灭活疫苗主要激发机体的体液免疫[21]。Villarreal等[22]报道了灭活疫苗主要激发机体的体液免疫。但Procajlo等[23]已报道，灭活疫苗中若加入相应的佐剂便能引发机体的细胞免疫。Vranckx等[24]报道，对于经强猪肺炎支原体毒株感染后支气管相关淋巴组织内巨噬细胞的浸润能力可被辉瑞公司生产的Mhp灭活疫苗降低。但Kick等[25]报道，灭活疫苗能够产生的细胞免疫能力是相当有限的。同年，Regia Silva Sousa 等[26]报道，Mhp疫苗可发生细胞免疫，但其免疫效果因猪的品种而异。Tzivara等[27]对两个猪场的猪进行了Mhp灭活疫苗的治疗效果的试验，得出的结论是：免疫猪虽没表现出临床症状，但体重均有所增加。Reynolds等[28]报道，在灭活疫苗中加入矿物油卵磷脂类佐剂其免疫效果良好。但Reynolds等[29]报道，某些情况下，灭火疫苗的成本要比猪肺炎支原体感染造成的损失更大，考虑到经济效益，是否选择灭活疫苗各个猪场要视其具体情况而定。

2.2 弱毒疫苗

目前投入生产并广泛使用的Mhp弱毒活疫苗为Mhp168弱毒株，研究均表明其经肺内注射后可突破母源抗体屏障。Feng等[30]报道，Mhp弱毒活疫苗经肺内注射后，其能突破母源抗体的影响并引发机体产生局部粘膜及细胞免疫。Li等[31]报道，添加佐剂的Mhp弱毒活疫苗可有效增加体液、细胞及粘膜免异的效果。

最新研究显示，占位效应被认为是弱毒活疫苗独特的免疫机制之一。周勇岐等[34]报道，Mhp弱毒活疫苗经肺内注射后，疫苗可占据肺泡表面所有可占用的空间，若此时，猪再次感染Mhp野毒株，肺泡表面已无空位可占，从而降低了猪肺炎支原体肺炎发生的概率。刘茂军等[35]用Mhp弱毒株对猪场的7000多头猪进行了临床试验，结果发现其免疫效果很显著。王晓阳等[32]研究规模猪场伪狂犬弱毒疫苗滴鼻免疫的效果时发现，弱毒疫苗菌株可通过占位效应来阻止野毒的感染。

2.3 基因工程疫苗

因猪肺炎支原体存在的密码子跟通用密码子有出入，使得猪肺炎支原体抗原蛋白在其他物种中难以表达，如若想在大肠杆菌系统中表达猪肺炎支原体抗原蛋白，就必须成功定点突变TGA为TGG才可行，所以生产疫苗便遇到了瓶颈。虽然如此，基因工程疫苗研究已有部分突破。

2.3.1 核苷酸还原酶(NrdF)的R2亚基重组疫苗[8]前面提过到了核甘酸环酶的一些特性，这里将简单介绍下，它在疫苗方面的应用及发展的状况。Fagan等发现了一个跟原核生物NrdF的R2亚基C末端具同源性与Mhp高免血清反应的克隆片段，将该片段克隆到沙门氏菌表达系统中，可检测到分子量大小为15 kD的一个杂合蛋白，而且其抗血清对Mhp的生长具抑制作用。将其制备的活疫苗通过口服免疫小鼠后，可在小鼠体内检测到肺部粘膜分泌的IgG和lgA与血清中抗重组NrdF都呈现明显的上升趋势。还发现只用杂合蛋白去免疫小鼠，结果检测到的IgG量没有注射重组蛋白的多。后来，Austen等在不同的沙门氏菌表达系统中表达插入的NrdF并比较分析了其免疫效果，虽然都出现了细胞免疫，但其效果因在表达系统中所用到的载体不同而各异。

2.3.2 表达文库免疫 所谓的表达文库免疫是指从猪肺炎支原体表达文库中筛选能表达猪肺炎支原体抗原的克隆制备抗原并免疫动物。研究报道，由经过改造的大肠杆菌质粒表达载体建立的猪肺炎支原体的表达文库，其保护效果良好。对于表达文库免疫的其他相关研究目前还未见报到，我们期待有更好的新发现。

2.3.3 粘附因子相关疫苗 研究报道，通过粘附因子与其他菌融合而制备的亚单位疫苗对动物的免疫效果相对良好。Okamba等[36]报道将rAdp97C以肌注和滴鼻两种方式来免疫小鼠，结果发现其免疫效果很显著。王亮等也证实Dnak-p97可刺激小鼠产生针对p97的抗体。

2.3.4 DNA疫苗 目前，对DNA疫苗的研究相对来说很少，Chen等[37]报道，通过构建DNA疫苗(pcDNA3/p42)并使其免疫小鼠，结果检测到IgGI、IgG2a、mRNA、IL-4、IL-2和IFN-γ在小鼠体内均呈上升趋势，还检测到脾细胞的增殖能力也大大加强了。

2.3.5 肽疫苗 肽疫苗作为新近发展起来的疫苗，它有传统疫苗不可比拟的优势，如其抗原成分简单，毒力不易恢复等等，但对其的研究报道目前还不多见。最新的研究报道显示，在肽疫苗的设计方面，噬菌体肽库的构建及筛选技术具有巨大的潜力，希望经筛选到的噬菌体抗原决定簇成为一种肽疫苗，当然，这需要进一步的功能实验研究。

3 展 望

猪支原体肺炎在世界范围内广泛存在,它具有发病率高、死亡率低的特点,该病一旦在猪场爆发便很难对其控制，给养猪业造成巨大的经济损失，我国也不例外。所以，研究它的致病机理找出有效的预防和控制该疾病的方法已成为当务之急。

以目前报道的猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白的免疫机理及疫苗发展的状况出发，今后应从以下方面着手:第一，发展高效的灭活疫苗和相应的免疫增效佐剂。就猪支原体肺炎灭活疫苗而言，首先，母源抗体对其有较大的影响，在使用时我们应采取相应的措施来避开这一影响。其次，如何生产具有高纯度和高滴度的灭活疫苗是目前颇为关注的问题，而且也是国际支原体组织在2012年大会上的五项主要议题之一。Villarreal等[38]与Chae[39]的最新研究表明，灭活疫苗并不能阻止野毒的感染。所以，我们要对猪支原体肺炎灭活疫苗进行优化:(1)选择高效而低毒的免疫增效佐剂来激发机体的细胞免疫并尽可能的减少免疫应激。(2)改善现有的生产工艺以得到高纯度和高滴度的抗原。(3)具良好的免疫原性应作为筛选菌株或者抗原最低标准。Simionatto等[40]对34个Mhp重组蛋白的免疫原性研究的结果为今后研发更高效的Mhp疫苗提供了可靠的依据。

第二，在现有基础上继续开发弱毒疫苗。为保证其高效免疫，我们可采取以下三项免疫措施：(1)使用弱毒活疫苗时，我们应采取早期免疫方式以保证弱毒疫苗的有效活力。(2)考虑到操作繁琐这一问题，我们可采用肺内免疫的途径，而且效率也高。(3)考虑到猪场还有其他疾病存在，在使用疫苗的同时还要使用各种抗生素，所以我们应选择肺炎支原体非敏感抗生素，以免降低其免疫效果。

第三，基因工程疫苗的研究相对来说较缓慢,应加大力度研制出更为高效实用的基因工程疫苗也是今后制备疫苗的一个重要措施。

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