分子标志物在监测植物重金属污染中的应用

陈慧男，胡大鹏，陈 琛，薛大伟，张晓勤

(杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036 )

分子标志物在监测植物重金属污染中的应用

陈慧男，胡大鹏，陈 琛，薛大伟，张晓勤

(杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 310036 )

通过某些特异敏感的分子标志物可以快速而有效地监测植物受重金属污染的状况.文章分类详述了金属结合蛋白、抗氧化酶防御系统、ATP酶、DNA损伤等各种生物分子作为标志物监测及预警植物受重金属污染的程度.

重金属；植物；环境污染；分子标志物

随着工业的快速发展，各种垃圾及污水的随意排放、含重金属化肥的不合理施用等，使得重金属渗入土壤，流入河流，最终污染了植物赖以生存的土壤及水体.研究表明，重金属可在生物体内富集，并沿食物链逐渐积累和放大[1].重金属很难降解，人类处于食物链的金字塔顶，将受到严重的危害.重金属对植物在形态方面的危害主要表现为根和茎生长迟缓，以及叶片失绿、卷曲；在生理生化方面则主要表现为光合作用和蒸腾作用受到一定程度的抑制.

早期诊断土壤或水体受到的污染状态，将有效控制植物受其危害，因此需要对重金属污染的状况进行灵敏、快速、准确地检测.生物标志物是指生物体暴露在有毒环境中时生物体在分子、细胞、生理生化水平等发生变化的信号指标[2].这种变化可有效反映生物体受环境污染的状态，从而早期预警重金属的毒害.常规化学检测在对评估重金属的生态环境毒性方面有一定局限性，而生物标志物提供了有效的检测手段，对早期诊断环境污染具有广阔的应用空间[3-5].

某些分子水平的生物标志物具有特异性、预警性和广泛性等优点，其研究已较为深入，如某些金属结合蛋白、抗氧化酶防御系统、ATPase、DNA损伤等.本文将介绍并详述这几种分子标志物在植物重金属污染监测中的应用现状.

1 金属结合蛋白

重金属污染可影响植物正常代谢，并改变植物体内的营养成分，如重金属污染会影响植物体内某些蛋白质的含量.用不同浓度的Cd处理草莓幼苗，导致草莓根尖可溶性蛋白质含量下降，且随着镉浓度的加大，这种效应更加明显[6].研究表明植物体内的金属硫蛋白(Metallothionein,MT)和螯合肽(PC)等一类金属结合蛋白可由重金属诱导产生，并反映环境中的重金属水平，因此可作为重金属暴露和早期预警的标志物，用于监测植物受重金属胁迫的风险及毒理学诊断指标.MT是一富含半胱氨酸及金属的低分子量蛋白质，其分子中含有大量巯基，与重金属Ag、Cd、Cu、Hg及Zn等有很强的结合力[7-8].MT还可以清除植物体内的自由基，增强植物的抗氧化能力.一些植物来源的MT基因已经被转到微生物体内，用于改良微生物在重金属污染的清除作用[9-10].此外，还有一些重金属转运蛋白在转录水平上与重金属离子的积累之间有相关性,在植物受重金属污染中也可以起一定监测作用[11-12].

2 抗氧化酶防御系统

抗氧化酶防御系统，也称为活性氧(ROS)清除系统，可保护生物免受自由基和活性氧的损伤.它包含了抗氧化酶(如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化酶GPX等)，以及一些小分子的化合物(如谷胱甘肽、维生素C和E等)[13-14].

受重金属镉污染时，植物细胞内产生大量自由基引起膜组分过氧化，从而改变细胞膜的结构与功能，同时重金属的富集直接破坏ROS系统中相关酶的活性，导致自由基清除功能受影响，最终影响植物正常生命活动[15-17].用低浓度Pb2+处理景天时，其叶片抗氧化酶系统活性会增强，自由基被清除；但长时间受到重金属胁迫，其体内的抗氧化酶系统受到破坏，POD、COD、CAT活性都降低[18].低浓度Pb2+处理辣椒幼苗[16]，幼苗的POD、SOD活性升高，当Pb2+浓度≥40 mg·L-1时，抗氧化酶活性降低，且处理时间越长效果越明显.同样，用重金属处理条斑紫菜(Porphyrayezoensis)，当重金属离子胁迫较轻时，藻体抗氧化防御系统发生诱导反应；当重金属浓度达到一定水平，所有酶的合成均受到阻碍，酶活性下降，说明重金属离子胁迫与藻体POD活性存在明显的时间及浓度效应关系[19].抗氧化酶防御系统只能在重金属低浓度下起短时的保护作用，Cu、Fe直接参与植物体内自由基的生成，而Cd间接产生自由基[20].

3 腺苷三磷酸酶(ATPase)

腺苷三磷酸酶(ATPase)存在于植物细胞质膜和液泡膜中，负责细胞内外的离子交换，为细胞正常活动提供能量物质ATP.已有较多研究表明，生物体内多种ATPase对重金属离子的暴露非常敏感，可用于监测植物的重金属污染.朱毅勇等[21]研究了Cu离子胁迫下印度芥菜根系细胞膜上P型ATPase活性变化，这种专一性运输Cu离子的细胞膜转运蛋白，通过水解ATP获得能量从而将Cu离子排除细胞，减轻其在细胞积累产生的毒性，但当外界Cu离子浓度达到16 μmol·L- 1时,该酶活性会呈现降低趋势.

重金属广泛污染土壤，促使水稻育种家培育不积累重金属的新品种，已知重金属ATP酶OsHMA3作为金属转运跨膜蛋白参与重金属的转运,可抑制水稻中镉积累，研究表明其同源基因OsHMA2也可参与水稻根和地上部的Zn和Cd的转运，从而降低重金属在细胞内的积累[22].

4 DNA损伤

正常情况下植物体内的遗传物质DNA稳定存在，但是在遭受环境污染，如电离辐射、紫外照射、化学试剂诱变等有可能损害DNA的结构，导致突变.植物在重金属胁迫下，可通过诱导体内的氧化反应影响DNA的结构，或损伤其修复系统，造成DNA损伤、染色体改变、DNA单双链断裂、染色单体交换及DNA蛋白交联等情况发生[23].DNA损伤的主要形式有碱基改变，错配、插入或缺失、DNA甲基化损伤、DNA链内和链间交联等形式等.张旭红等[24]通过彗星实验研究表明，Cd能够引起蚕豆叶片DNA损伤，但不同浓度的Cd造成不同程度的损伤：当镉质量浓度为5 mg·L-1时，单链DNA损伤，形成碱性不稳定位点；10 mg·L-1时DNA双链开始断裂；20 mg·L-1时各类损伤明显增加，DNA双链断裂尤其明显.重金属胁迫下，有多种方式检测植物的DNA损伤，如DNA的甲基化水平、RAPD和AFLP等.

4.1 DNA的甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组中最常见的DNA共价修饰形式，甲基化不涉及碱基序列的改变，主要是影响基因表达[25-26].甲基化与植物生长关系密切，一些研究证实DNA甲基化会引起植株形态改变，并影响植株的正常发育[27].葛才林等调查了3种重金属离子(Cu2+、Cd2+、Hg2+)对小麦和水稻各器官中DNA甲基胞嘧啶含量的影响，结果表明重金属胁迫下水稻和小麦叶片中DNA甲基化水平的提高与水稻和小麦叶片蛋白质合成受抑制程度正相关[28].

4.2 RAPD图谱

随着PCR技术的发展，衍生出PCR-RFLP、SSCP、DDRT、RAPD、RT-PCR、AP-PCR等技术，可高效、灵敏、快速检测DNA分子的多态性.其中RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术的应用尤为广泛.该技术以10个碱基的寡核苷酸单链作为引物，对基因组DNA扩增产生的片段可反映相应区域DNA的特性.每种生物的RAPD图谱有特异性，因此可作为一种有效的分子生物标记物.

Conte等[29]以模式植物拟南芥幼苗为材料，将其暴露在重金属环境下，发现其基因组的RAPD谱带均明显增加，随着重金属暴露时间延长，胁迫所造成的DNA损伤越明显.Mengoni等[30]将麦瓶草(SileneparadoxaL.)置于铜矿污染中，发现增加了2个特异的RAPD谱带.Ahmad等[31]利用RAPD技术对As胁迫下的水稻DNA稳定性进行了检测.上述研究说明RAPD谱带可作为检测重金属胁迫的分子标志物.

4.3 AFLP技术

AFLP技术(amplication fragment length poly-morphism)具有多态性强、检测位点多、重复性高等优点，是一种有效的分子标记技术.当基因组DNA出现损伤导致限制性酶切位点发生改变，或者因引物特异识别位点发生突变，或者因两个限制性位点间的碱基发生改变时都将产生多态性DNA指纹谱带.Labra等[32]利用AFLP方法分析了铬对拟南芥造成的DNA损伤，并且定性和定量地分析了污染物的遗传毒性效应，进而鉴定出各污染物的目标靶基因序列.

5 结 语

在监测重金属污染时，某些基于分子水平上的生物标志物，具有特异性、预警性和广泛性等优点，受到越来越多的关注.随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术也日新月异，基因芯片、单核苷酸多态性标记、变性梯度凝胶电泳、微卫星标记等新技术也不断问世.分子生物标志物在污染物暴露和毒性效应的早期指示方面显示了其优越性并取得了很大进展，为环境污染物的检测提供有效的方法，促进了污染生态学领域的发展.但这些分子标志物如何响应重金属的接触，如何运用这些分子标志物指示特异的土壤重金属污染等问题，会随着研究的不断深入而得到解决，更多高效、灵敏的DNA分子标记技术应用于环境污染物的检测，为污染生态毒理诊断提供有力的依据.

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TheApplicationofMolecularMarkersinMonitoringPlantsSufferingHeavyMetalPollution

CHEN Huinan, HU Dapeng, CHEN Chen, XUE Dawei, ZHANG Xiaoqin

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Some sensitive molecular markers can rapidly and effectively monitor the heavy metal pollution in plants. The paper elaborated the applications of various biomarkers like metal binding protein, antioxidant enzyme defense system, ATPase and DNA damage in monitoring and pre-warning plants suffering heavy metal pollution respectively.

heavy metal; plant; environmental pollution; molecular marker

2013-01-11

浙江省科技厅项目(2012C22039)；浙江省自然科学基金项目(Y3100074)；杭州市科技局项目(20100933B08).

张晓勤(1976—)，女，讲师，硕士，主要从事作物学研究.E-mail:xiaoqinzhang@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.04.007

Q89

A

1674-232X(2013)04-0319-04

收稿日期：2013-01-31

基金项目：国家自然科学基金项目(41206163)；热带海洋环境国家重点实验室(中国科学院南海海洋研究所)开放基金项目(LTO1205).

张 瑰(1973—)，女，副教授，博士，主要从事偏微分方程、反问题与变分同化问题研究.E-mail:zhanggui73@163.com