毫米波急性辐照对大鼠脊髓P物质和c-fos表达的影响

张彦文，姚权，许商成，余争平，张广斌

随着电子技术的不断进步，毫米波技术迅猛发展，且广泛应用于通讯、遥感、地下探测、导航、医疗等方面。毫米波在医疗方面的应用与其热效应有关。较低剂量毫米波辐照下，皮肤温度上升缓慢，且上升幅度有限，可保持一定的热效应从而达到治疗的目的。但较高剂量的毫米波辐照可使皮肤温度快速上升，较短时间内达到痛觉阈值，产生剧烈疼痛，如持续辐照则可产生皮肤损伤甚至导致死亡[1-2]。我们的前期研究发现，较高剂量毫米波(35GHz)急性辐照30s，SD大鼠皮肤温度即可达48℃以上，产生疼痛反应，造成皮肤损伤，且大鼠局部皮肤中P物质(substance P，SP)含量明显升高[3]。脊髓是疼痛冲动向高级中枢传递的中转站，是疼痛传入系统的重要组成部分，对疼痛的传入起调制作用。本研究通过检测脊髓SP和c-fos的表达变化，进一步探索毫米波痛觉效应的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RT-PCR试剂盒、SYBER Green I荧光染料购自Toyoba公司，小鼠抗c-fos单克隆抗体(2G9C3)购自美国Abcam公司，小鼠抗GAPDH单克隆抗体(KC-5G4)购自上海康成公司。

1.2 主要仪器 Bio-Rad普通PCR仪和定量PCR仪，Du-640紫外分光光度计，水平电泳仪，垂直电泳仪，凝胶图像成像系统，Bio-Rad蛋白电泳系统，Odyssey荧光扫描仪。

1.3 实验动物及分组 健康成年SD大鼠96只，雌雄各半，体重250±20g，由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供，自由进水、饮食。随机分为对照组、辐照30s组、辐照1min组、辐照3min组，每个辐照组在辐照后又分为0min、5min、10min、1h、3h五个观察时间点，每个时间点6只实验动物。

1.4 辐照模型 将大鼠置于毫米波反射系数为零的毫米波暗室内进行辐照，室内温度控制在20℃，相对湿度80%。辐照前大鼠背部局部脱毛，辐照时将大鼠放置于自制容器中固定，局部脱毛皮肤暴露于毫米波焦斑处，用毫米波(35GHz，40W/cm2)分别辐照30s、1min、3min。毫米波辐照后，以20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，剪开背部皮肤及肌肉组织，取出辐照皮肤对应节段的脊髓组织，用生理盐水洗去血迹，备用于后续实验。

1.5 Real-time RT-PCR检测大鼠脊髓SP和c-fos mRNA表达 取脊髓组织标本(每只大鼠50mg左右)，采用Trizol试剂盒提取总RNA，具体操作按说明书进行。提取的RNA经电泳鉴定，并行紫外分光光度计检测含量及纯度后备用。取总RNA 1.0μg，65℃变性5min后冷却，加入M-Mulv反转录酶，在总体积20μl的反应体系中42℃反应60min，85℃、5min灭活M-Mulv反转录酶，冷却至4℃用于Realtime PCR。Real-time PCR反应条件：95℃ 30s；95℃15s，58℃ 20s，40个循环；72℃ 90s。采用2－ΔΔCt法计算产物相对含量。引物序列如下：GAPDH上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'，扩增片段长度138bp；SP上游5'-ACTGGTCCGACAGTGACCAAATC-3'，下游5'-CCCGTTTGCCCATTAATCCA-3'，扩增片段长度117bp；c-fos上游5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3'，下游5'-AAAGTTGGCACTAGAGACGGACAGA-3'，扩增片段长度170bp。

1.6 Western blotting检测大鼠脊髓c-fos蛋白表达取脊髓组织标本(每只大鼠50mg左右)，加入1ml组织蛋白裂解液，匀浆，冰上冷浴30min，4℃条件下20 000×g离心30min，取上清，Lowry法测定蛋白含量，分装，－80℃保存。制备15%分离胶和5%浓缩胶，取100μg总蛋白上样后电泳。先用80V电压将样品电泳至分离胶面，然后调整电压至100V，电泳100min，转印至NC膜上(150mA，40min)，于PBS配制的5%脱脂奶粉中封闭3h，1∶10 000小鼠抗GAPDH室温孵育90min。取出孵育完毕的NC膜，用0.1% TBST在摇床上中度洗膜10min×3次，置于小鼠c-fos单克隆抗体(1∶1000)中室温摇床孵育3h，以TBST洗涤10min×3次，置于山羊抗小鼠红色荧光二抗(1∶5000)中，室温于摇床上轻度晃动，避光孵育1h，TBST避光洗涤10min×3次，PBS洗膜5min×2次，蒸馏水漂洗，除去残留的TBST；采用Odyssey荧光扫描分析测定吸光度(A)值。

1.7 统计学处理 数据结果以x±s表示，组间比较采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)及独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SP、c-fos、GAPDH PCR产物的电泳鉴定Real-time RT-PCR产物电泳结果显示，SP、c-fos和GAPDH扩增片段长度与实际相符，无非特异性扩增，无DNA污染(图1)。

2.2 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤30s后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达的变化 经毫米波急性辐照大鼠局部皮肤30s，辐照后各时间点对应节段脊髓SP和c-fos mRNA相对表达水平与对照组相比均无显著差异(P＞0.05，图2)。

图1 大鼠脊髓SP、c-fos、GAPDH PCR产物的电泳鉴定Fig. 1 Identification of SP, c-fos and GAPDH PCR production in rat spinal cord1. DNA marker; 2. GAPDH; 3. c-fos; 4. SP; 5. Negative control

2.3 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤1min后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达的变化 经毫米波急性辐照大鼠局部皮肤1min，在辐照后10min对应节段脊髓SP和c-fos mRNA相对表达水平与对照组相比显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而其他时间点与对照组比较均无明显差异(P＞0.05，图3)。

图2 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤30s后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达变化(n=6)Fig. 2 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to millimeter wave (MMW) for 30s in rats (n=6)

图3 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤1min后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达变化(n=6)Fig. 3 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 1min in rats (n=6)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control

2.4 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤3min后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达的变化 经毫米波辐照大鼠局部皮肤3min，在辐照后5min和10min对应节段脊髓SP和c-fos mRNA相对表达水平与对照组相比明显升高(P＜0.01)，辐照后1h仍显著高于对照组(P＜0.05)，而辐照后即刻和3h与对照组相比无显著差异(P＞0.05，图4)。

2.5 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤对对应节段脊髓c-fos蛋白表达的影响 毫米波急性辐照SD大鼠局部皮肤30s和1min后，对应节段脊髓c-fos蛋白表达在各时间点与对照组相比均无显著差异(P＞0.05)；而经毫米波辐照大鼠局部皮肤3min，在辐照后5min及10min对应节段脊髓c-fos蛋白表达与对照组相比显著升高(P＜0.01)，其他时间点c-fos蛋白表达水平与对照组相比无明显差异(P＞0.05，图5)。

图4 毫米波急性辐照大鼠局部皮肤3min后对应节段脊髓SP和c-fos mRNA表达变化(n=6)Fig. 4 SP and c-fos mRNA expression in the corresponding segment of spinal cord after regional skin exposure to MMW for 3min in rats (n=6)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control

3 讨 论

脊髓背角是疼痛冲动向高级中枢传递的中转站，是疼痛传入系统的重要组成部分，也是脑干下行抑制的作用部位，对疼痛的传入起调制作用。解剖学、免疫组织化学研究揭示，感觉神经元及其周围和中枢的投射区内存在一些肽类，其中包括SP[4]。SP由速激肽家族的前速激肽A基因经转录、翻译、加工后产生，在伤害性刺激、炎性反应、腺体分泌、变态反应中均具有不同作用。SP通过受体参与脊髓伤害性信息的传递，在痛觉调制中发挥重要作用[5-6]。

研究表明，SP可加强C纤维诱发的脊髓背角伤害性神经元放电，在猫脊髓背角微电泳导入SP可引起伤害性感受神经元的去极化，其时程与诱发放电的兴奋效应相平行，表明伤害性初级传入释放的SP能作用于突触后神经元，使突触后膜发生离子通透性变化及电位变化，从而改变突触后神经元的功能状态，激活伤害感受神经元，完成信息传递的功能[7]。由此可见SP是伤害性传入末梢释放的一种兴奋性递质，在脊髓水平参与伤害性信息传递，产生致痛作用。伤害性刺激可引起脊髓背角伤害性敏感神经元兴奋，背根神经节小型神经元胞体内合成的SP经快速轴浆运输至初级传入神经元的外周端神经末梢，使局部皮肤SP含量升高。前期研究发现，毫米波急性辐照后局部皮肤SP含量升高(辐照后第5min和10min显著升高)[3]，这可能是由于对应节段脊髓SP mRNA表达水平升高导致合成的SP蛋白增加，然后经快速轴浆运输至皮肤游离神经末梢所致。

即刻早期基因是指在受到外界刺激时机体在短期(数分钟)内即刻表达的基因，甚至不被蛋白合成抑制剂所阻断，其转录是快速、一过性的，在体内发挥第三信使的作用。c-fos原癌基因是即刻早期基因中的一种，参与细胞的正常生长、分化过程，c-Fos蛋白可耦联细胞外信息与细胞内靶基因的转录，是激活神经元的第二信使与目的基因表达之间的信息传递中介，起到核内第三信使的重要作用，其在中枢神经系统内的表达与痛觉调控密切相关[8]。在正常生理状态下，c-fos基因在多种细胞不表达或低表达，但缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等可诱导中枢神经系统中c-fos基因的表达，是刺激作用下最早的反应基因[9]，且其表达可作为接受一定刺激后神经元激活的标志[10]。但不同的刺激是否通过共同的机制诱导c-fos表达，或者不同的刺激有不同的诱导机制目前尚不清楚。

图5 毫米波急性辐照对脊髓c-fos蛋白表达的影响(n=6)Fig. 5 Effects of acute MMW irradiation on c-fos protein expression in rat spinal cord (n=6)(1)P＜0.01 compared with control

各种伤害性刺激均可诱导c-fos在中枢神经系统多级神经元中的表达。在脊髓水平，急性疼痛刺激后2h，c-fos的表达即可作为神经元活化的标志物[11]。脊髓存在不同的伤害性传入通路，尽管表达部位、时程、数量有一定差异，但其表达多出现在疼痛相关区域[12]。作为快速反应基因家族的一员，c-fos基因的表达具有快速、短暂的时间依赖性特征。当机体受到外界刺激作用时，中枢神经系统c-fos基因在数分钟内即出现表达，解除相应刺激后，其表达也很快消失，不能持续。

既往研究发现，外周伤害性刺激后脊髓内初级传入神经末梢释放SP、谷氨酸等神经递质，可影响突触后神经元内的Ca2+浓度，提高cAMP水平，导致c-fos基因的表达[13]。同时，SP与其相应的受体结合也可促进c-fos的表达[14]。外周伤害性热刺激也可引起大鼠脊髓c-fos的表达增加[15]。本研究发现，毫米波急性辐照大鼠局部皮肤后，对应节段脊髓c-fosmRNA和蛋白表达均明显上调，且与脊髓SP mRNA表达和皮肤SP含量变化在时相上存在一定相关性[3]，提示毫米波辐照后皮肤SP含量增加可能与辐照导致的热疼痛刺激诱导对应节段脊髓SP和c-fos的表达增加有关，但其具体作用途径尚有待进一步研究。

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