驱动蛋白Eg5抑制剂在肿瘤研究中的进展＊

罗兴燕，张 梅，刘 进综述，舒 茂△审校（.重庆理工大学药学与生物工程学院 400054；.重庆医药工业研究院有限责任公司 400600）

有丝分裂双极纺锤体是癌症化学疗法中一个已证实的药物靶点，如紫杉烷和长春碱等作用于微管抑制纺锤体形成，在临床上是一类很成功的抗肿瘤药物。但微管在细胞的高尔基体、突触小泡等细胞器的转运具有重要作用，对轴突微管也有抑制影响。因此，作用于微管的抗增殖药物具有不可逆转的神经毒性，长期使用这类药物会使肿瘤产生抗药性［1］。寻找有丝分裂纺锤体的其他靶点是目前开发新的抗肿瘤药物的重要途径。纺锤体驱动蛋白家族是纺锤体形成的重要蛋白，已成为近年来靶向抗癌化学疗法的新靶点［2］。驱动蛋白在有丝分裂的纺锤体形成、细胞分裂和增殖中发挥关键作用。驱动蛋白家族有650个成员，被分为14类亚家族，主要有细胞分离和蛋白转运两大类主要功能。Eg5是纺锤体形成中的重要蛋白，在不发生细胞分裂的细胞中没有表达。因此，Eg5抑制剂在神经细胞中没有毒性作用，不具有抗微管药物的作用［3］。近年来已经成为抗癌药物的研究热点，本文就Eg5参与肿瘤的机制及其抑制剂研究现状综述如下。

1 Eg5结构和功能

Eg5也称KIF11，是驱动蛋白家族5中BimC的同源四聚物，属于N型驱动蛋白。Eg5共有1 057个氨基酸残基，主要有3个结构域：N端的启动区、卷曲螺旋结构的茎干区和C端尾巴区。启动区前有20个氨基酸残基，开始于β1折叠结构的Val21，终止于 RAK 模序 R6结构上的 Lys357。Asn358－Pro363是连接启动区和中间卷曲结构（Glu364－Val523，Cys684－Lys716，Gln782－Arg826）的连接子（linker）。Eg5的 C末端区域（Tyr829－Leu1057）包含一个p34cd2磷酸化位点，在体内Thr927是p34cd2蛋白激酶一个主要的磷酸化位点［4］。Eg5的二级结构主要由β片层和α螺旋结构组成［5］。

Eg5四聚体形成两两二聚体相互交叉，棒状末端反向平行在微管上滑动产生外向的力。N－末端驱动蛋白沿着微管（MTs）滑动，主要功能是在中心体分离组装形成双极纺锤体时，提供一个正向牵力，并防止双极性纺锤体在染色体分离后期之前崩解［6］。因此，Eg5常被人熟知的功能就是形成纺锤体，参与有丝分裂。研究者通过RNAi干扰技术、Eg5抗体中和及小分子抑制剂抑制Eg5均可以阻滞肿瘤细胞在有丝分裂中期，随后导致细胞死亡［2］。Bartoli等［7］最近研究提出Eg5同时可以参与多肽的合成，其小分子抑制剂可能会影响细胞有丝分裂间期的蛋白合成［8］。但是目前主流的观点还是集中在Eg5对细胞有丝分裂中期的影响，其中最具有意义的就是抑制剂和Eg5作用形成Monoastral纺锤体［9］。Monoastral纺锤体最初是Mayer等学者在1999年发现化合物Monastrol与Eg5形成复合物导致有丝分裂中止，纺锤体中止在有丝分裂中期的特征结构定义。Monastrol是第一个发现的Eg5蛋白特异性小分子化合物抑制剂，主要是与Eg5结合后通过构象改变抑制二磷酸腺苷（ADP）从Eg5中的释放，是一类三磷酸腺苷（ATP）的非竞争性抑制剂［10］。Kaan等学者用Eg5与S－三苯甲基－L半胱氨酸（S－trityl－L－cysteine，STLC）结合的晶体复合物0.2nm分辨力来研究抑制剂与Eg5结合方式，抑制剂与Eg5结合后使Eg5构象改变，导致ADP不能从Eg5中释放形成 Monoastral纺锤体［5］。

Eg5与有丝分裂密切相关，有研究证明了Eg5在肿瘤中表达失调，与肿瘤的发生、发展相关。Nowichi等［11］就利用基因芯片分析中发现Eg5在慢性粒细胞性白血病中高表达。南开大学的生命科学遗传细胞实验室发现在胰腺癌细胞中Eg5也高表达，导致细胞快速增殖［12］。这些研究都为Eg5可以作为一个潜在的抗肿瘤药物靶点提供了依据，使Eg5的抑制剂开发成为了近年来的热门研究。

2 Eg5抑制剂

随着Monastrol的发现和报道，寻找Eg5新的抑制剂成为许多医药公司和研究者研究开发抗肿瘤药物的热点，Eg5抑制剂筛选多是基于化合物的高通量筛选和已知化合物的结构改造，结合多学科的发展如计算机、生物信息学、生物化学、医学等来完成，抑制剂的种类和数量不断地被研究扩展。如2004年发表的STLC化合物，其发现过程是Debonis从NCI数据库最开始筛选到2 869个小分子化合物用于测试他们抑制微管－Eg5中的ATP酶活性，结果有154个化合物具有抑制Eg5的ATP酶活性，154中有15个化合物的孔雀绿测试中抑制结果为阳性，其中，5个化合物抑制HeLa细胞，使有丝分裂中止。STLC是其中活性最好，能抑制Eg5能使纺锤体形成Monoastrol纺锤体［13］。STLC发现后，Debonis又利用计算机药物设计软件和化学合成对STLC结构优化得到了一系列活性更好的化合物，STLC的抗癌活性在膀胱癌，前列腺癌等体外实验研究中得到了验证［3，14］。

参与Eg5抑制剂的研究中包含了一些大型的医药公司和研究单位，由于这些科研工作者的不断努力，近10多年的时间越来越多的Eg5抑制剂和研究方法被研究报道，其中，活性好的化合物已 经进入了临 床研究［13，15－19］，如Ispinesib、AZD4877化合物已经进入Ⅰ／Ⅱ期临床研究。

2.1 Ispinesib／SB－715992 Ispinesib／SB－715992是属于嘧啶酮类化合物由GlaxoSmithKline和Cytokinetics公司开发，Ispinesib的作用机制与Monastrol抑制方式相同，均通过结合Eg5形成Monoastral纺锤体，中止细胞有丝分裂，但比Monastrol具有更好的活性，是第一个进入肿瘤临床试验的驱动蛋白Eg5ATP酶的变构的小分子抑制剂［20］。在临床前研究中，Ispinesib抑制人类和小鼠细胞系的IC50为1.2～9.5μM，在体外用20μM的Ispinesib作用于SKOV3卵巢癌细胞可导致有丝分裂中止。对裸鼠移植瘤模型，如结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌，腹腔注射Ispinesib 30mg／kg，均发现肿瘤的生长延迟。2003年Glaxo Smith Kline公司进入非小细胞肺癌Ⅱ期临床研究，至今Ispinesib有16个项目进入了临床Ⅰ／Ⅱ研究，随后多个研究机构进行多种肿瘤的临床研究，所有的研究中没有明显的药物毒性产生，剂量限制性毒性（DLT）表现为中性粒细胞减少，没有观察到明显的神经毒性［21－22］。但是在恶性黑色素瘤、头颈部肿瘤、前列腺癌、肝癌Ⅱ期临床研究中作用效果不好，可能原因是由于在动物移植瘤中瘤细胞分裂占大部分而人肿瘤分裂相对少，药物的半衰期短，作用于靶点位置的时间不够，造成在人的肿瘤中效果不佳［23］。临床研究中的14个项目已经完成，其中，2个还在继续研究。

2.2 AZD4877 AZD4877由Astra Zeneca研究开发，也属于嘧啶酮类化合物。AZD4877是从一系列新颖的驱动蛋白纺锤体蛋白（KSP）抑制剂筛选出的抑制Eg5活性的化合物，兼具优异的生化性质和药物特性的适合于临床开发的Eg5－ATP酶的变构的小分子抑制剂［24］。AZD4877研究对很多来源于实体瘤和血液瘤的细胞株都有抑制作用［16］。裸鼠移植瘤模型的原发性膀胱肿瘤模型、利妥昔单抗不敏感非霍奇金淋巴瘤模型（DoHH2T53）中，在 AZD4877剂量的耐受范围，25mg／kg可以检测到Monoastral纺锤体，这些均为AZD4877临床研究提供了依据。AZD4877在西方和日本实体瘤患者的Ⅰ期临床研究都有很好的耐受性和安全性，但是并没有观察到高的抗癌活性［17］。目前进入临床的6个项目都因为AZD4877在Ⅱ期临床研究中没有作用而中止研究［16－17，25］。

2.3 SB－743921／ARRY－520 嘧 啶酮 类 化 合物Ispinesib和AZD4877在多种肿瘤Ⅱ期临床研究结果显示效果不好，抗肿瘤活性不高。第二代嘧啶酮类化合物SB－743921与前2种化合物相比，它的临床前研究结果显示活性更好，在Holen报道的SB－743921的药代动力学和生物学效应得到令人满意结果，推荐Ⅱ期临床研究的剂量为4mg／m2，每天静脉滴注1h并持续21d。以Ispinesib结构改造的Eg5抑制剂还有ARRY－520等多个嘧啶酮类化合物衍生物，也进入了临床研究，目前，还没有临床数据报道，他们的活性比Ispinesib更高［26］。

2.4 MK－0731 二氢吡唑类、二氢吡咯类化合物是 Merck公司研究实验进行高通量筛选和结构改造合成的一批具有良好活性的Eg5抑制性的化合物，其作用机制与Monostral一样，与Eg5结合后通过构象改变抑制ADP从Eg5中的释放，也属于一类ATP的非竞争性抑制剂［27］。其中，化合物 MK－0731是优化改造后具有良好的化学特性和生物特性，在体内外表现出低毒性和好的药代动力学性质。化合物能抑制对紫杉醇药物依赖的肿瘤生长。临床前实验研究表现出良好的最大剂量耐受，不良反应小，安全性好，MK－0731在实体瘤的Ⅰ期临床实验中没有观察到明显的肿瘤减小［28］。

虽然Eg5抑制剂在临床前研究结果取得好的进展，但是在临床中的研究的结果大多数都是不尽人意，进入人体的安全性好但是基本也没有活性。通过上面几种化合物的分析研究，临床前期在动物模型有药物作用，但在临床研究中患者的体内没有作用，可能原因在动物模型中进行有丝分裂的肿瘤细胞的比例比肿瘤患者的肿瘤细胞比例高，抑制剂作用患者时间不足以造成肿瘤细胞有丝分裂中止，抑制剂作用的肿瘤细胞株不敏感等，造成在动物模型中的效果好。这也需要研究者的继续研究来突破这些缺点。

3 Eg5研究趋势

Monastrol是第一个被发现的Eg5驱动蛋白抑制剂，与Eg5结合形成Monoastral纺锤体后使有丝分裂中止造成细胞凋亡后死亡。Eg5在稳定的细胞中不表达，不对神经细胞造成毒性，克服了目前抗微管肿瘤药物造成的不良反应和耐药性。因此，Eg5成为了热门研究靶点，国内外大型医药公司和顶尖实验室都努力寻找最优的Eg5抑制剂并希望开发新一代抗癌药物，用以克服现在抗微管药物出现的不良反应，其中，一些化合物已进入了临床试验抗癌研究阶段。至今有30多种化合物进入了临床研究，但是没有一种化合物成为药物上市。这些化合物虽然不良反应小，但因在体内抗癌药物活性不高而没有继续被研究。Eg5抑制剂开发面临着几个问题：Eg5抑制剂对什么类型肿瘤敏感？在体内如何提高药物和肿瘤作用时间来中止有丝分裂？目前研究显示，Eg5抑制剂单一疗法效果不佳，联合用药虽然有研究报道，但没有发现协同作用。

Eg5是一个很吸引人的药物靶点，但其药物抑制剂要用于抗癌药物治疗仍需要研究人员的不懈努力。现阶段亟待解决的主要问题是：Eg5的研究应走向何方；如何开发新的筛选方法寻找新的Eg5抑制剂；如何建立高通量筛选方法为抑制剂快速找到敏感的肿瘤株；如何同现有的肿瘤抑制剂联合用药，以发挥不同的药物作用以及改变药物的剂型以提高在体内的时间，在Eg5中寻找到新的抑制方式，发现新的抑制剂。还有，Eg5属于驱动蛋白的一个大家族，找寻其他的驱动蛋白靶标也成为现在抗肿瘤药物发展的新方向。

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