甘薯病毒病检测技术研究

陈玉霞 谷 峰 张朝臣 周天虹 邵湘愉

（1湖北省农科院农产品加工与核农技术研究所 武汉 430064；2湖北省农科院农业质量标准与检测技术研究所 武汉 430064）

甘薯是利用块根和茎蔓繁殖的作物，因而易受病毒病的感染。目前已报道的甘薯病毒有10余种，主要有甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯黄矮病毒等[1]。甘薯感染病毒后，一般会在薯叶和薯块上产生明显病症。病毒病是甘薯的重要病害，是导致甘薯产量降低和种性退化的主要原因之一，它广泛存在于世界各甘薯产区。我国山东、江苏、北京等地的调查显示，由病毒病造成的甘薯产量损失一般达20%～30%，严重的可达 50%以上。作者曾在湖北省农科院甘薯资源圃调查105个品种（品系），在湖北甘薯主产区咸宁、郧阳、襄阳等地调查30多个品种（品系），结果表明，我省甘薯病毒病发病率高达61%，有的品种病株率甚至高达100%。甘薯病毒病已成为湖北省甘薯生产的限制因子之一。因此，对湖北省甘薯病毒病的检测技术进行研究十分必要。本文通过症状诊断、病毒电镜鉴定和巴西牵牛（IPOMOEA SETOSA）嫁接检测三种方法对甘薯病毒病进行了初步研究，以寻求准确检测诊断甘薯病毒病的方法。

1 材料与方法

1.1 设备

电镜为H-600，加速电压75kv。

1.2 试验材料

甘薯“99、1164、1030、1026”、5193等由湖北省农科院甘薯组提供，南薯88采自恩施，巴西牵牛引自江苏省徐州甘薯研究中心。

1.3 试验方法

1.3.1 巴西牵牛种子处理

用小刀开破种壳，并用 0.5%硫酸铜浸泡10min，然后用清水浸泡48h，再倒去清水播种。

1.3.2 靠接

巴西牵牛和显症甘薯植株均用盆栽，植株长至一定长度后，将巴西牵牛和甘薯各一钵放在一起，在预备接合的部位（离土壤10cm～15cm处），一株向上作一切口，一株向下作一切口，然后将两切口嵌在一起，用包装带包扎。待伤口愈合后，剪去甘薯植株的下部，让其上部与巴西牵牛共生在一起，观察并记录巴西牵牛新生叶片的生长情况。此外还设两株巴西牵牛作空白对照。一个多月后，即可将嫁接成功的巴西牵牛叶片、以及空白对照的巴西牵牛叶片取下进行电镜鉴定。

1.3.3 电镜观察

取样。剪下薯蔓浸泡在注入自来水的广口瓶中，室温下数日即可长根。取样时间为电镜观察的前一天。取样部位为病状明显的叶片，如皱缩花叶型、卷叶型、叶片斑点型等。植株如无明显病状则剪取第三片叶（从生长点往下数，已展开的第三片叶）。一般取叶中部的叶肉组织约1cm2，也可取叶柄和茎部组织。

负染法。将样品（叶肉、茎或叶柄）剪下，放入研钵中，用剪刀剪碎，再研磨呈浆状，立即加入数滴2%磷钨酸，放置约1h。用带有支持膜的铜网沾取研钵内上层汁液，待其凉干后，在电镜下观察拍片。

超薄切片法。按常规超薄切片法，取病变叶片进行双固定→乙醇系列脱水→浸透→包埋→切片→双染→电镜观察。

2 结果与分析

2.1 症状诊断

当病毒侵染甘薯以后，一般会在甘薯植株上出现典型症状，这些症状是诊断甘薯病毒病的重要依据。湖北省甘薯病毒病主要的症状类型有三种[2]：

2.1.1 皱缩花叶型

幼叶具浅黄色斑块，整个叶片皱缩粗糙，凸凹不平。发病严重者分枝较多，叶片发育不良，呈鸡爪状，叶缘呈波状扭曲，有的叶片左右不对称。表现皱缩花叶病症的品种较多，占被调查品种的42%。

2.1.2 卷叶型

病苗叶片边缘向上（个别向下）呈失水状卷缩，严重者卷缩成杯状。病叶成泡状不平，并散生不规则黄斑或小黄圆斑。内卷叶症状在春季苗期表现严重，夏季高温期症状也不隐退，只是程度较苗期轻。

2.1.3 叶片斑点型

a）黄斑型。叶面散生小型黄色圆斑，直径0.5mm～1.5mm，有的叶片边缘不规则 ，散生褪绿半透明斑，呈油渍状。

b）紫环斑型。秋凉后在病株的老叶上易出现紫色斑块，有的斑块中间黄绿色、外围紫红色，以后逐渐变成枯斑。

甘薯病毒病的症状表现受病毒种类、甘薯品种、生育期、环境条件等多种因素影响而复杂多变，因此，根据症状只能对甘薯病毒病作初步诊断[3]。

2.2 电镜鉴定

表1 甘薯病毒电镜鉴定结果

甘薯病毒电镜鉴定是通过直接采取样本肉眼观察病毒粒子的形状和大小，快速而直观。

从表1来看，黄斑型、紫环斑型和卷叶型的甘薯病株叶片中存在线状病毒粒子，其长度为1050 m～1 650m，形态和大小无明显差异。

镜检皱缩花叶型病株6株，其中一株5193病叶中有长度为1 500m和1 150m长线状病毒粒子，一株“99”病叶皱缩部位有长度为640m病毒粒子，在另一株“99”皱缩病株叶片中还发现许多类菌原体粒子，这种粒子椭圆形，直径 117m～187m，在类菌原体的大小65 m～700 m范围内[4]，还有三株皱缩花叶型病株叶片中未发现病毒。

在电镜观察中还发现甘薯病叶汁液涂片中病毒浓度很低，在视野里很难发现病毒粒子，能观察到时，在一个视野中也常只有1粒～2粒。

2.3 巴西牵牛嫁接检测

2.3.1 嫁接检测

嫁接检测就是利用嫁接传染进行检测。嫁接传染是利用接穗和砧木二者之间细胞的有机结合，使病毒从一个部分进入到另一个部分。巴西牵牛对多种侵染甘薯的病毒（SPFMV、SPMMV、SPLV、SPVMV、SPCLV）敏感，且受病毒侵染后，叶片上易产生系统症状，如沿叶脉网状褪绿、叶面皱缩、褪绿斑及花叶等。

表2 甘薯病毒病巴西牵牛检测结果

甘薯“1030”皱缩花叶病株与巴西牵牛嫁接后，88%巴西牵牛表现出症状，沿叶脉网状褪绿，或沿主脉两侧褪绿，或主脉基部大块黄斑，叶面普遍皱缩。与甘薯“99”皱缩花叶病株嫁接后的巴西牵牛67%表现出病状，沿叶脉网状退绿，叶面皱缩。甘薯“1164”内卷叶病株和南薯88黄斑病株与巴西牵牛嫁接后，分别有86%和80%巴西牵牛出现病症，其症状与甘薯病株症状基本一致。

2.3.2 电镜验证

用甘薯材料“99”、南薯88、5193与巴西牵牛嫁接，一个月后，将巴西牵牛新生叶片取下进行电镜观察，结果见表3。

从表3可以看出，表现皱缩花叶、紫环斑、叶面有褪绿半透明斑的甘薯病株与巴西牵牛嫁接后，巴西牵牛新生叶片出现沿叶脉褪绿、叶片皱缩且网状褪绿等症状，电镜检测均有病毒，而表现正常或仅仅表现叶片皱缩现象的甘薯植株与巴西牵牛嫁接后，巴西牵牛一般表现正常，电镜检测不到病毒。

利用靠接方法进行嫁接，甘薯植株和巴西牵牛的成活率达90%以上，此法用以检测甘薯病毒灵敏、准确，简便易行、成本低。

表3 甘薯病毒电镜鉴定验证巴西牵牛检测结果

3 讨论

3.1 在甘薯皱缩花叶型、卷叶型、黄斑型、紫环斑型病株叶片中观察到的病毒粒子均为长线形，其长度为640m～1650 m。

3.2 甘薯皱缩花叶型病株叶片的电镜观察结果不稳定，同一材料表现出不同的观察结果，有时可观察到病毒粒子，有时取材观察又没有。特别是具有明显症状的材料，有时也全部未能发现病毒。这可能是由于甘薯病毒在体内消长规律尚不清楚，取材制片方法不十分恰当所致。

3.3 一株用“1164”嫁接的巴西牵牛，在其显症叶片中发现线形病毒，其病毒浓度明显高于甘薯病叶中病毒浓度。这是否由于寄主不同所致有待进一步研究。

3.4 在电镜观察中，还发现一株“99”的皱缩花叶型病叶中有疑为类菌原体存在，形状为椭圆形粒子，直径为117m～187m。但仅观察到一次，以后多次观察均未发现。

3.5 巴西牵牛与显症甘薯植株靠接后，叶片表现皱缩而且褪绿者，电镜鉴定均有病毒存在，巴西牵牛嫁接传毒的结果和病毒电镜鉴定的结果基本相符。利用靠接方法进行嫁接，植株成活率达90%以上，而且传毒率高，系统症状明显，便于识别和诊断。所以，用巴西牵牛作指示植物对甘薯病毒病进行诊断是可行的。

[1] 张振臣,马淮琴,张桂兰.甘薯病毒病研究进展.河南农业科学,2000(9):19～21

[2] 陈玉霞,张朝臣,周天虹,等.湖北省甘薯病毒病调查研究.湖北植保,2009(2):8～10

[3] 邢继英,杨永嘉.甘薯病毒病检测方法.植物保护,1995,21(2):38～40

[4] 陶正平.植物类菌原体及其纯化方法简介.植物保护,1990,16(1):43～44