TGF-β3在臀肌挛缩症患者中的表达及其作用

许 刚，赵晨光(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，乌鲁木齐 830000;通讯作者，E-mail:zcgxinjiang@126.com)

臀肌挛缩症(gluteal muscle contracture，GMC)是一种多发于儿童，由多种原因引起的臀部肌肉及其筋膜的纤维变性，继发髋关节内收、内旋功能障碍，表现特有步态的临床综合征。臀肌挛缩症基本病理变化是间质增生及纤维化，其发病机制尚未完全清楚，注射因素、免疫因素及遗传因素等可能参与了发病过程［1-4］。转化生长因子-β3(transforming growth factor- β3，TGF-β3)是一种具有多种生物学作用的细胞因子，参与调控细胞增殖与分化、机体的生长和发育、组织修复、肿瘤发生等生理病理过程［5，6］，最近研究发现 TGF-β3与组织纤维化密切相关［7-9］。为了进一步讨论TGF-β3在臀肌挛缩症中的作用，本实验检测TGF-β3在臀肌挛缩症患者臀肌挛缩带中的表达水平，并初步探讨TGF-β3在挛缩带形成过程中的作用。

图1 挛缩带及挛缩带旁臀大肌组织中TGF-β3的表达 (免疫组化，×400)Figure 1 Expression of TGF-β3in the fibrotic muscle and the adjacent muscle by immunohistochemistry (×400)

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2011-10～2013-05在我院住院实施臀肌挛缩症松解术的23例臀肌挛缩症患者，其中男性10例，女性13例，年龄7-27岁，平均18.6岁。患者在进行手术时进行取材，取材包括挛缩带及挛缩带旁正常臀大肌组织，每份组织分为两部分，一部分组织用生理盐水冲洗后立即置于冻存管中在液氮中保存，另一部分组织进行甲醛固定，制作切片后备用。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 TRIzol液购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ购自大连宝生物工程有限公司，TGF-β3单抗购自美国 Santa Cruz公司，SAP试剂盒购自美国Vector公司，PCR引物由北京奥科公司合成，荧光定量PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2.2 实时定量PCR检测TGF-β3mRNA的表达水平 从液氮中取出标本，研磨后加入1.0 ml TRIzol液提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，严格按照说明书进行操作。参照Genbank cDNA中的 TGF-β3及内参β-actin基因序列设计引物，TGF-β3上游引物5’-AAGCGGCGTTT-GGCAATATC-3’，下游引物5’-GACGAAGAAGCGGACTGTGT-3’，产物大小212 bp;β-actin上游引物5’-GCCGCCAGCTCACCAT-3’，下游引物 5’-TGCCCACCATCACGCCC-3’，产 物 大 小 153 bp。PCR反应体系包括:10.0 μl SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、上、下游引物(10 μmol/L)各 2.0 μl、6.0 μl DNA模板。反应条件:95℃ 10 s预变性，95℃ 5 s、61℃ 30 s 40个循环。基因的相对表达采用2-ΔΔCt分析。其中实验组ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct，对照组ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.2.3 免疫组化检测TGF-β3的表达 将4 μm厚度的石蜡切片在60℃烘箱中烘烤30 min，二甲苯脱蜡后进行下行梯度酒精中脱苯、水化。切片浸泡于柠檬酸抗原液中进行抗原修复，滴加3%H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶，然后滴加封闭血清，封闭非特异性抗体。滴加小鼠抗人TGF-β3单克隆抗体(1∶200)，孵育盒中密封，4℃过夜后SAP染色试剂盒常规显色，显微镜下观察结果并照相，以PBS代替一抗作为空白对照。结果判定:以低倍镜和高倍镜分别观察切片，阳性染色为细胞间质有红色条索状物质着色，染色明显高于背景，根据染色深浅分级［10］:①阳性面积百分率:无显色记为0分，1%-25%记为1分，26%-50%记为2分，51%-75%记为3分，大于76%记为4分。②染色强度:未着色记为0分，浅红色记为1分，红色记为2分，深红色记为3分。③综合评分:两项相加0-1分为(-)，2-3分(+)，4-5分为(++)，6-7 分为(+++)。本实验最终计数采用双盲法分别由两位病理医师计数，差异超过10%重新计数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TGF-β3mRNA表达水平结果

实时定量PCR检测结果发现TGF-β3mRNA在挛缩带中的表达水平(1.76±0.63)明显高于挛缩带旁臀大肌组织的表达水平(1.28±0.49)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 TGF-β3的免疫组化结果

挛缩带中TGF-β3弥漫性分布于成纤维细胞和血管内皮细胞中(图1，见第1007页)，其中2例为(+)，16例为(++)，5 例为(+++)，而在挛缩带旁臀大肌组织中TGF-β3表达量非常少，其中4例为(-)，18例为(+)，1例为(++)。

3 讨论

臀肌挛缩症由Valderrama在1970年首次报道，常发生于儿童，如不及时治疗可影响患儿的生长发育。臀肌挛缩症的发病是一个复杂的过程，共同的基本病理变化是间质增生及纤维化。其发病原因尚未完全清楚，普遍认为与儿童反复肌肉注射有关，此外免疫调节等因素也参与了发病［1-4］。

TGF-β是一种具有多种生物学效应的细胞因子，参与多种生理病理过程，与病理性瘢痕形成、组织器官纤维化有密切联系［11-14］。TGF-β共有5种亚型或异构体，其中 TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3存在哺乳动物中，其中TGF-β1可以作用于成纤维细胞，促进其合成大量的Ⅰ、Ⅲ、型胶原蛋白、弹性蛋白、整合素、蛋白多糖等多种细胞外基质成分，从而促进创伤愈合及瘢痕形成，是一种重要的致纤维化因子［13，14］。人 TGF-β3的基因定位于染色体 14q24，与TGF-β1有77%的氨基酸同源性，研究证实 TGF-β3通过与TGF-β1竞争转化生长因子βⅡ型受体(TβRⅡ)可以拮抗TGF-β1的作用，可以减轻瘢痕形成和纤维化［6，14］。我们前期研究发现 TGF-β1在臀肌挛缩带中的表达增加，可能参与了臀肌挛缩症的发生发展过程［15］。为了研究TGF-β3在臀肌挛缩症中的作用，我们利用免疫组化检测了臀肌挛缩带中TGF-β3的表达，结果发现挛缩带中TGF-β3弥漫性分布于成纤维细胞和血管内皮细胞中，呈强阳性，而在挛缩带旁的臀大肌组织中TGF-β3表达量非常少。同时我们利用实时定量PCR在 mRNA水平上证实TGF-β3在挛缩带中的表达水平明显高于自身周围臀大肌的表达水平。结合本实验结果及我们前期研究结果［15］，提示臀肌挛缩症患者臀肌挛缩带中TGF-β1、TGF-β3上调可能与臀肌纤维化有关，TGF-β1的致纤维化作用与TGF-β3的抗纤维化作用之间的动态平衡参与了肌肉纤维化发生发展过程。

综上所述，TGF-β3在臀肌挛缩症患者的臀肌挛缩带中高表达，TGF-β3可能参与了臀肌挛缩症的臀肌纤维化过程。进一步研究TGF-β3在臀肌挛缩症不同发病阶段的作用可能为揭示臀肌挛缩症具体发病机制及生物学治疗提供理论依据。

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