高效液相色谱质谱联用仪分析不同产地蜂胶的多酚类成分

罗照明 张红城

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

高效液相色谱质谱联用仪分析不同产地蜂胶的多酚类成分

罗照明 张红城

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

建立了蜂胶中的酚酸和黄酮的高效液相色谱质谱联用（HPLC-MS）定量方法。不同来源的蜂胶样品置于乙醇中，在70℃的条件下提取2h，提取物通过5μmC18对称性的250 mm×4.6 mm柱子分离。通过线性梯度洗脱方法分离，二极管阵列检测器（DAD）设置在200~450 nm，MS测定范围设在100~1000 Da。其中的大部分化合物主要是通过与标准品的HPLC色谱图的保留时间（RT）和紫外光谱对照进行定性的。没有标准品的，通过色谱的在线的紫外数据和质谱进行确认。欧洲、中国和阿根廷蜂胶的主要特点是含有黄酮和酚酸，主要成分为柯因（2~4%），松属素（2~4%），短叶松素乙酸酯（1.6~3%）及高良姜素（1~2%）。巴西蜂胶主要含有阿替匹林C、咖啡酰奎尼酸和黄酮类物质。如果考虑将黄酮的总含量纳入质量标准，我们认为低于11%的黄酮含量的蜂胶是次品，黄酮含量在11~ 14%为可以接受的，黄酮含量在14~17%的属于质量好的，高于17%属于高质量的。LC－DAD－MS分析方法可以用于蜂胶的化学成分的分析和商业上的蜂胶制品的质量鉴定。

蜂胶；多酚；LC－DAD－MS

1 引言

蜂胶是蜜蜂从植物幼芽与树干裂缝处采集的树胶与其上颚腺分泌物（如β-糖苷酶）和蜂蜡等混合加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜜蜂用蜂胶来堵塞蜂箱的缝隙，维持蜂箱的温度，阻止外来生物的侵入，而且抑制内部微生物的生长，并将大型的入侵者包裹以防止其腐败。蜂胶是一种传统的用于治疗各种疾病的民间药材，大量的研究表明，蜂胶有抑制细菌真菌生长、抗病毒、抗炎、局部麻醉、抗氧化、免疫刺激、止龋、抗癌等生物活性。

蜂胶包含不同种类的化学成分，包括酚酸及其酯类、黄酮类（黄酮、黄烷酮、黄酮醇、二氢黄酮、查尔酮）、萜烯类、芳香醛、芳香醇、脂肪酸、二苯乙烯和β-类固醇。蜂胶不能直接使用，需要提取纯化来除去惰性成分并保护多酚类成分。事实上，和其他成分相比，蜂胶里多酚类成分被认为是具有治疗作用的生物活性成分。因此，此类物质被广泛的研究，也建立了很多有效的分析方法。本文主要目的是研究不同地区采集的蜂胶样品的质量。为了这个目的，建立了蜂胶样品中黄酮和酚酸定性及定量的LC－DAD－MS分析方法。通过分子离子峰（MS）和相应的离子碎片（MS/MS）对不同的化合物进行确认。

2 材料和方法

2.1 化学药品

柯因（C），高良姜素（G），松属素（P），槲皮素（Q），山奈酚（K），异鼠李素（I），樱花素（S），异樱花素（iS）,芹菜素（A），刺槐素（Ac），5,7-二甲氧基松属素（P-DME）和7-甲氧基柯因（C-7ME）购买于里昂诺德公司（Genay，France）。咖啡酸苯乙酯（CAPE），咖啡酸（CA），P-香豆酸（pC），阿魏酸（FA），肉桂酸（CiA），异阿魏酸（iFA）和3,4-二甲基咖啡酸（DMCA）购买于Sigma公司。水由MilliQ设备制备。蜂胶样品由Specchiasol s.r. l赠送。

2.2 蜂胶样品

蜂胶样品于最近5年从中国（12），韩国（1），阿根廷（25），巴西（9），智利（7），乌拉圭（4），巴拉圭（1），法国（6），波兰（12），德国（1），马其顿（4），俄罗斯（1），克罗地亚（12），意大利（9），保加利亚（1），加拿大（2）购买，并储存在－20℃温度下。

2.3 样品准备

取冷冻的蜂胶样品200 g，用磨粉机将其充分粉碎，称量5g于70mL乙醇中，置于70℃的温度下2h，然后冷却，过滤，固体残渣用同样体积的乙醇提取两次。然后将3次（每次70mL）的提取液准确定容至100 mL，过0.22μm的膜，用甲醇稀释50倍，10μL注入HPLC系统中。

2.4 LC-DAD-MS分析

色谱系统是配备有二极管阵列检测器2996、三倍的四级杆质谱分析器的Alliance 2695。分离的色谱柱为5μmC18对称性的250 mm×4.6 mm柱子，流速设置为1.2 mL/min，柱温维持在30℃，分流的比例为5:1。分离方法为线性梯度洗脱（洗脱程序如下：20%B 6 min，在4min内20~30%B，在30min内30~40%B，在20min内40~60%B，在20min内60~90%B，10min内90%B。色谱数据的紫外检测范围在200~450 nm，检测波长290nm。质谱设置为阴离子和阳离子下模式，范围在100~1000 Da。毛细管出口电压3.0 kV，孔电压在20V，离子源的温度为130℃，解离的温度350℃。数据通过具有对离子碎片分析的Quan-Optimize选项的Masslinx 4.0软件(Micromass)获得。每一个酚酸和黄酮的标准品的母液为20mg溶于20mL的甲醇中，然后稀释进入色谱系统获得标准曲线，标准曲线的范围在2~ 50μg/mL。

2.5 方法验证

LC-DAD-MS方法是经过线性、量化及检测、准确度、峰纯度和重复性验证过。量化的限定值（S/N的比率为6）和检测限（S/N的比率为3），通过标准溶液的稀释获得。准确度通过包含有CA，pC，FA，iFA，DMCA，CiA，CAPE，Q，C，P，G，C-7ME和P-DME标准品的混合物，分别以三种含量（2，10，20 mg）加入到5g的蜂胶标准品进样进行评价。加入标准品的蜂胶在最佳的条件下提取，然后通过黄酮和酚酸评价回收率。峰的纯度和确认由LC-DAD-MS和LC-MS/MS进行分析。通过连续5天分析蜂胶样品来验证实验的精度。通过评价标准品保留时间的差异来验证重复性。

3 结果与讨论

3.1 样品准备

通过不同蜂胶样品出现过的黄酮和酚酸，来混合标准品。第一组和第二组的提取率分别为92.8±2.1%和7.2±2.1%，第三组的黄酮和酚酸没有检测。

3.2 方法验证

每一个标准品以5个浓度梯度来绘制标准曲线，3次独立地测定每一种浓度。标准曲线的线性关系用回归方法分析，标准曲线的方程如表1。加入标准品的蜂胶的黄酮和酚酸的提取的准确度分别为98.2±3.1%和97±2.4%。通过一天之中5次和连续5天的再现性考察实验仪器的精密度，变异系数低于5.4%。量化限（LOQ）和检测限（LOD）分别为2和0.8μg/mL。关于重复性，在三次的进样中，最大的相对标准偏差为2%（柯因，松属素和高良姜素）。

表1 蜂胶提取物中不同多酚的标准品的线性回归方程（Y=mX+q）a

图1 不同地区来源蜂胶样品中发现的黄酮、酚酸及其酯类的结构

图2 南美洲（A：阿根廷，B：巴西）和欧洲（C：意大利）蜂胶醇提物的290nm处的HPLC色谱图。峰名称及结构见图1。

图3 短叶松素-5-甲氧基乙酯（MW328，峰18）在低碰撞能量（10ev）下的断裂模式。离子碎片[m/z]-59就是乙酯部分。

图4 短叶松素-3-丙酸酯（MW328，峰35）解离模式

3.3 LC-DAD-MS和LC-MS/MS分析

蜂胶中的多酚的成分主要是一些肉桂酸的衍生物和黄酮，它们的结构如图1所示。这些成分非常复杂，其成分的确认需要HPLC结合在线的紫外检测器及MS/MS方法。另外，也有可能出现错误的鉴别，这种情况在一篇基于LC-ESI-MS方法的文献中报道柚皮素的存在。我们的研究表明，柚皮素在蜂胶中不存在，可能的原因是引用的文献提到的，而且易与短叶松素混淆。柚皮素和短叶松素有相同的分子量、紫外光谱及相似的保留时间。因此，LC-DAD-ESI-MS方法仍是不充分的，LC联合在线的MS/MS检测方法仍需要仔细辨别这些成分。事实上，结合MS分析柚皮素的离子碎片[m/ z]-151，而短叶松素产生的典型的离子碎片有[m/z]-253。

（未完待续）

罗照明（1986－），硕士研究生，研究方向为食品科学。

张红城，E-mail：zzhc@sohu.com