奶牛乳房炎溶血性病原菌分离培养及药敏试验

顾冬花 （青海省大通县畜牧兽医站 810100）

奶牛乳房炎(Mastitis)通常也称奶牛乳腺炎，是指因微生物感染或因理化刺激引起的一种奶牛乳腺炎症，其特点是乳中体细胞尤其是白细胞增多，以及乳腺组织发生病理变化。是危害H奶牛养殖业健康发展的常见疾病H之一，不仅造成乳性状异常，品质下降，而且随着抗菌素的反复长期使用，导致病原菌耐药菌株的增加和牛奶中抗生素残留超标，严重影响人类身体健康，甚至会危害食品卫生和公共卫生安全。近年来，随着奶牛畜产品市场价格的不断上涨，规模奶牛养殖业的相继建成，由于在实际生产中缺乏专业的饲养管理人员，缺乏预防意识，再加上对疾病的了解、认识及防治意识薄弱，在不清楚病因的情况下，乱用、滥用抗生素，结果造成耐药细菌越来越多，耐药范围越来越广，给临床治疗带来困难。鉴此，为了明确掌握大通县某奶牛场引起奶牛乳房炎的主要致病菌，笔者于2012年12月采集该牛场症状严重病牛的乳样进行了细菌分离培养和药敏试验，为指导本场合理有效的用药提供了科学依据，对有效控制细菌耐药性的产生及传播具有重要意义。

1 材料

1.1 培养基 营养琼脂培养基、绵羊血琼脂培养基。

1.2 药敏纸片 药敏纸片购于杭州生物试剂有限公司。

1.3 试验仪器 离心机、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、显微镜、平皿、锥形瓶、接种针、超净工作台等。

1.4 奶样 无菌采集大通县某奶牛场奶牛乳房炎症状严重病牛的乳样。

2 方法

2.1 奶样采集 准备灭菌离心管和消毒酒精棉。用温水彻底清洗患乳房炎奶牛的乳房，然后用75%的酒精棉对乳房消毒，待酒精挥发后无菌采集乳样，弃去前3把乳，收集第3把以后的乳样，每区采集1份5～10ml到无菌离心管中，立即送回实验室检查，不能及时送检的保存在4℃冰箱中。

2.2 溶血菌分离培养 将采集的奶样以3000r/min离心15min，弃去上层液体，保留沉淀在底部的奶样和少量液体，将底部奶样无菌操作分别接种在绵羊血琼脂平板和营养琼脂平板上，37℃培养18～24h，观察结果，初步筛选含溶血的菌落。

2.3 革兰氏染色 用灭菌接种针分别挑取两种溶血性菌落，涂片，然后用革兰氏染液进行染色，待干后镜检观察细菌形态及染色特性。

2.4 溶血菌分离纯培养及药敏试验 再挑取革兰氏染色为阳性的溶血性链球菌无菌操作分别接种于新的绵羊血琼脂培养基上，37℃恒温纯化培养18～24h。取2个无菌EP管，各装200μl无菌生理盐水，分别挑去多量纯化培养的菌落于无菌生理盐水中稀释，用移液器移去100μl稀释菌液到新的绵羊血琼脂平板上，用L棒将菌液涂布均匀，放置3min，然后用灭菌镊子将阿莫西林、氯霉素、庆大霉素、链霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素、先锋V号、四环素药敏纸片贴于平板上，6片药敏片/培养皿，每个菌设3个重复，置于37℃培养箱中培养24h，用游标卡尺测量每个药敏片的抑菌环直径。

2.5 敏感性判定标准 依据临床实验室标准化协会CLSI的抗菌药物敏感性试验标准，通过抑菌圈直径大小判定病原菌对药物的敏感性、中介和耐药性。

3 结果

3.1 溶血菌分离培养结果 经24h培养，接种奶样的营养琼脂平板上长出一种灰白、半透明、表面光滑、边缘整齐、稍隆起的露珠样小菌落，透光观察菌落略显蓝色；接种奶样的绵羊血琼脂平板上也长出类似的菌落，并出现α和β溶血现象。

3.2 革兰氏染色结果 经革兰氏染色两种溶血菌落均为革兰氏阳性菌，镜下观察到两种菌落排列成链状，α-溶血菌成单个链状存在，链短且多；β-溶血菌链成对存在，链长且少，说明α、β两种溶血菌都是革兰氏阳性链球菌。

3.3 药敏试验结果 根据药物敏感性判定标准，结果显示，该奶牛场α-溶血性链球菌对阿莫西林、庆大霉素、红霉素、青霉素、先锋V号耐药，对氯霉素、四环素敏感，对链霉素、环丙沙星中介；β-溶血性链球菌对阿莫西林、庆大霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素、先锋V号耐药，对氯霉素、四环素敏感，对链霉素中介。结果见附表。

附表 被检溶血性链球菌药敏试验结果 (mm)

4 讨论

（1）本试验在大通某奶牛场不同奶牛乳房炎病例的奶样中分离得到2种溶血性链球菌，经细菌分离培养、革兰氏染色等试验证明该奶牛场的主要致病菌是α和β溶血性链球菌，而且两种链球菌具有多重耐药性，奶牛养殖业主为了获得高产奶量，提高经济效益，常常使用大量抗生素预防与治疗乳房炎，这也正是导致耐药菌株增加，给奶牛乳房炎治疗带来困难的原因之一。因此，为了明确指导该奶牛场乳房炎治疗时有效合理的用药，本试验对分离的两种溶血性链球菌作了药敏试验，结果显示治疗该奶牛场乳房炎的最佳抗生素是氯霉素、四环素，其次是链霉素。建议在使用抗生素的基础上，同时采用中草药方剂进行治疗和物理辅助治疗。（2）奶牛乳房炎是奶牛养殖业面临的一个重大难题，凡是养殖奶牛的国家，都有乳房炎的存在，并且引起奶牛乳房炎的原因也比较复杂，溶血性链球菌在自然界分布较广，存在于空气、水、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、咽喉等，可通过直接接触、空气飞沫或皮肤、粘膜伤口感染；因此，防治本病应采取综合措施：坚持预防为主，防治结合的原则。保持牛体和牛舍的清洁、干燥，挤奶前后乳房的严格消毒、挤奶仪器清洁消毒、操作人员卫生健康等；加强饲养管理制度，根据奶牛在不同生产阶段的营养需求给予合理的膳食，维持机体最佳生产技能，降低产乳期和干乳期的发病率；H奶牛场要定期对生产奶牛进行健康体检，一旦发现患乳房炎的奶牛应立即隔离治疗H，较严重者可以淘汰，对病牛使用的一切用具及环境进行彻底消毒处理；奶牛场定期进行乳房炎的细菌分离和药敏试验，以便更好的指导奶牛场疾病的防控和合理用药。

[1]王正兵, 严作廷, 罗金印等.我国奶牛乳房炎常见病原菌的耐药性检测[J].贵州农业科学, 2011,39(4): 139-141.

[2]易明梅, 黄奕倩, 朱建国等.上海地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医学报, 2009,29(3): 360-363.

[3]杨锐, 李英伦,李金良等.四川雅安临床型奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医杂志, 2009,45(4): 41-42.