HGF及G-CSF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

高 勇，梅浙川*，蒋明德

(1.重庆医科大学附属第二医院消化内科，重庆400016;2.成都军区总医院消化内科，四川成都610083)

近年来，关于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的研究已经成为干细胞研究的热点，BM-MSCs 在不同条件的诱导下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、神经元等［1－2］。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是现在已知的肝细胞最强的促有丝分裂剂，被大量用于肝相关干细胞体外诱导分化的实验，可调控BM-MSCs 分化为肝细胞［3］。粒细胞集落刺激因子(granlocyte-colony stimulating factor，G-CSF)是一个大小为20 ku的糖蛋白，G-CSF 被广泛的用作于化疗时的辅助药物以及干细胞移植前的动员，关于G-CSF 体外诱导的报道很少。研究显示，用0.1 μmol/L G-CSF 培养的BM-MSCs 表达的HGF水平最高［4］;血清中添加了G-CSF 后可以促进BM-MSCs的增值，并且能提高BM-MSCs 的活性［5］。本实验的目的是探讨HGF 以及G-CSF 可否诱导大鼠BM-MSCs 分化为肝样细胞，为干细胞的研究提供更有效的诱导方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD 大鼠，3 ～4 周，体质量80 ～100 g，［四川华西医科大学实验室(SCXK(111)2009-09)］。

1.2 主要试剂

胎牛血清和低糖培养基(Hyclone 公司)，Trizol RNA(宝生物公司)，反转录试剂盒(Fermentas 公司)，引物由上海生工合成，肝细胞生长因子(Peprotech 公司)，重组人粒细胞集落刺激因子注射液(山东齐鲁制药公司)，小鼠抗大鼠甲胎蛋白单克隆抗体和小鼠抗大鼠白蛋白单克隆抗体(Orbigen 公司)，羊抗小鼠(博士德公司)。GAPDH 内参(上海康城公司)。兔抗鼠CD45-FITC、CD34-PE、CD90-FITC 和CD105-PE 单抗(Santa 公司)。

1.3 大鼠BM-MSCs 的鉴定以及体外分组及诱导

取P3 代的大鼠BM-MSCs，胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，取2 ×105个细胞，分别加入兔抗鼠CD45-FITC、CD34-PE、CD90-FITC 和CD105-PE 单抗，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪进行检测。

取P3 代BM-MSCs 细胞，接种在6 孔板中，约1.2 ×104个/孔，待1 ～2 d后细胞生长状况良好，长满1/3 ～1/2个孔后，分别加入已配置好的培养液。实验分为:对照组:10% 胎牛血清培养基，0.1 μmol/L G-CSF 干预组，20 ng/mL HGF 干预组，HGF 联合G-CSF 共同干预组(0.1 μmol/L G-CSF +20 ng/mL HGF)，分别将诱导后第7、14 和21 天提取细胞总RNA 以及总蛋白。

1.4 RT-PCR 检测白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA 转录

分别用RNAiso Plus 提取诱导第7、14 和21 天细胞的总RNA，再用Fermentas 公司反转录试剂盒合成cDNA，以GAPDH 为内参，GAPDH 引物序列F5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG，R5'-GTCCAC CACCCTGTTGCTGTAG，产物大小496 bp。引物为AFP:F5'-ACTCCGGTATCAACC ACTGC，R5'-GGTC TTTGCAGCACTTCTCC，扩增产物长500 bp。ALB:F5'-TCTATGCCCCAGAACTCCTTTA，R5'-CACTCCTT GTTGATTTTGGTGA，扩增产物长289 bp，所有的引物均由上海生工合成。按照以下条件进行扩增:94 ℃2 min;94 ℃30 s、55 ℃45 s、72 ℃1 min扩增30 个循环，72 ℃1 min。将扩增PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳成像。

1.5 Western blot 检测白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)表达水平

将诱导第7、14 和21 天的细胞提取总蛋白，10%分离胶液以及5%浓缩胶液SDS-PAGE 电泳，每组加入50 μg总蛋白，电泳后转移到PVDF 膜上，封闭，加入小鼠抗大鼠甲胎蛋白单克隆抗体(1∶500稀释)和小鼠抗大鼠白蛋白单克隆抗体(1∶800 稀释)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP 标记的山羊抗小鼠抗体(1∶10 000稀释)，再孵育1 h，暗室和UVP曝光。用ALB/GAPDH、AFP/GAPDH 的吸光度比值作为ALB、AFP 的相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠BM-MSCs 分离培养及诱导结果

镜下所见，P0 代BM-MSCs 24 h贴壁，3 ～5 d后细胞呈梭状，形成小细胞集落，逐渐增大，呈漩涡状;20 ng/mL HGF 干预组，HGF 联合G-CSF 共同干预组诱导第7 天，部分梭状细胞变成圆形细胞，诱导14 d大多数细胞变圆，并形成集落，形似肝细胞(图1)。

2.2 大鼠BM-MSCs 流式细胞表面标记结果

P3 代BM-MSCs 细胞表面标志物CD34、CD45、CD90 和CD105 表达量分别为:CD34-PE 0.3%、CD45-FITC 0.1%、CD90-FITC 99.6% 和CD105-PE 99.8%(图2)。

2.3 RT-PCR 检测肝细胞ALB、AFP mRNA 转录水平

对照组、0.1 μmol/L G-CSF 干预组均没有检测到ALB 和AFP mRNA 水平表达。20 ng/mL HGF 干预组和HGF 联合G-CSF 共同干预组在诱导后第7，14 和21 天均检测到ALB mRNA 水平表达，随时间递增，同一时间后者表达量高于前者(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05);在诱导后第7、14 天检测到AFP mRNA 水平表达，随时间递减，第21 天没有检测到AFP mRNA 水平表达，两组在同一时间比较(P＜0.01)(图3，4)(表1)。

2.4 Western blot 检测肝样细胞ALB 和AFP 蛋白水平

对照组、0.1 μmol/L G-CSF 干预组均未检测到ALB 和AFP 蛋白水平表达。20 ng/mL HGF 干预组和HGF 联合G-CSF 共同干预组在诱导后第7、14 和21 天均检测到ALB 蛋白水平表达，随时间递增，后者表达量高于前者，同一时间差异相比(分别为P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);在诱导后第7、14 天检测到AFP 蛋白水平表达，随时间递减，第21 天没有检测到AFP 蛋白水平表达，两组在同一时间差异相比(P＜0.05)(图5，6)(表2)。

3 讨论

骨髓中BM-MSCs 含量很低，占所含细胞的0.01% ～0.001%，并随着动物年龄的增长会逐渐降低。本实验选取3 ～4 周的幼年SD 大鼠，用贴壁培养法获的原代BM-MSCs。迄今为止，对BM-MSCs表面标志物还不确定，本实验流式细胞术鉴定表面标志，CD34、CD45 阴性，高表达CD90、CD105，符合骨髓间充质干细胞的流式细胞表面标志［6－8］。

图3 诱导后各组细胞ALB 和AFP 基因水平表达Fig 3 ALB and AFP detected by RT-PCR after induction

表1 各组不同时间ALB(AFP)mRNA/GAPDH 吸光度值Table 1 Absorbance ratio of mRNA of ALB or AFP to GAPDH on different days for every group

表2 各组不同时间ALB(AFP)蛋白/GAPDH 吸光度值Table 2 Absorbance ratio of protein of ALB or AFP to GAPDH on different days for every group

图6 第7、14、21 天ALB 和AFP 蛋白表达Fig 6 Tthe expression of ALB and AFP protien detected by Western blot on 7th、14th and 21th day

本实验20 ng/mL HGF 干预组和HGF 联合G-CSF共同干预组检测到了ALB 和AFP 基因水平和蛋白水平的表达，说明HGF 能够诱导BM-MSCs 分化为肝样细胞，这与既往研究一致，用50 ng/mL HGF 诱导BM-MSCs，RT-PCR 以及Western blot 检测AFP 和ALB 表达水平，表明HGF 能诱导BM-MSCs分化为肝样细胞［9］;用HGF、aFGF 和OSM 诱导BM-MSCs，并证实HGF、aFGF 和OSM 诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性［10］。另外，HGF 联合G-CSF 共同干预组同20 ng/mL HGF 干预组相比，均检测到了ALB 和AFP 基因和蛋白水平的表达，并且趋势是一致的，每个指标并在同一时间比较有统计学意义，这与既往研究类似。研究发现添加0.1 μmol/L G-CSF 培养BM-MSCs 能够显著提高BM-MSCs 增殖能力，并且促进很多生长因子的产生［11］。由此得出，G-CSF 对HGF 的诱导起了协同作用，可能的机制是促进细胞的增殖，以及促进细胞产生HGF 有关系，还需要进一步的实验研究。

综上所述，本实验建立了一种有效的BM-MSCs分化为肝样细胞诱导方案，为干细胞的研究提供参考，但是肝内病理微环境复杂，究竟什么浓度的G-CSF以及HGF 诱导效果更好，是否有其他更强的诱导剂可以用于体外实验等问题，尚待进一步的实验研究。

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