雷红冲剂对腔内治疗后血管再狭窄影响的实验与临床研究

韩 冰，葛长青，张宏光，高 洁，李令根，周晨光，吉国辉，杨 錚，张 亮

雷红冲剂对腔内治疗后血管再狭窄影响的实验与临床研究

韩 冰1，葛长青1，张宏光1，高 洁2，李令根2，周晨光1，吉国辉1，杨 錚1，张 亮1

目的：观察雷红冲剂对下肢动脉内治疗后血管支架内再狭窄的作用。方法：健康新西兰大白兔24只，骼动脉血管内支架植入成功后随机分为：裸支架组（A），环孢素A组（B），雷红冲剂组（C）和环孢素A加雷红冲剂组（D）。记录支架植入前及后28 d血管直径，对血管组织切片行免疫组化及电镜观察。另选下肢动脉闭塞患者80人，随机等分为对照组和雷红冲剂组行试验治疗，观察治疗后不同时间前炎因子水平的变化及下肢动脉血管通畅性。结果：家兔骼动脉支架内再狭窄率分别为51.4±1.69%（A），10.9±0.71%（B），21.3±1.89%（C）和10.1±3.09%（D）；下肢血管通畅率雷红冲剂组明显高于对照组（P＜0.05）,血浆IL-10和IL-18水平及IMT（下肢动脉内-中膜厚度）显著减低（P＜0.05）。结论：环孢素A及雷红冲剂对支架内再狭窄有不同程度的抑制作用，免疫排斥反应可能为重要机制之一，雷红冲剂科有效地干预支架内再狭窄。

免疫排斥反应；支架内再狭窄；雷红冲剂

血管内支架植入后再狭窄（ISR）已有文献报道[1-2]，血管内支架作为一种异物植入后发生再狭窄的机制及相关因素目前尚不十分明确及肯定。本文旨在探讨免疫排斥反应参与ISR的形成过程及是否为引发其发生的重要机制之一，并观察雷红冲剂对下肢动脉腔内治疗后ISR的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性新西兰白兔24只，体质量（2.0±0.30）kg，2～3月龄，购于河北医科大学实验动物中心。许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。

1.2 试剂及药物 选用SP-9001/9002 His-tostain TM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒；抗体选用Mouse-Anti-PCNA增殖细胞核抗原(PCNA)；Rabbit-Anti-VEGF血管内皮生长因子(VEGF)；Rabbit-Anti-CDK2细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)；Rabbit-Anti-P21细胞周期调控蛋白(p21Cip1)。

血管内支架：ev3冠状动脉植入裸金属支架（乐普（北京）医疗器械股份有限公司），血管内支架直径3.0 mm，血管内支架长度10～18 mm。

药物Cyclosporin A（CSA），瑞士诺华制药有限公司生产；雷红冲剂，主要成分为雷公藤、红花、川牛漆、黄芪、甘草，河北长城制药厂加工(每袋含生药5 g)。

1.4 主要仪器设备 BX60型显微镜（日本OLYMPUS），DU640分光光度计（美国贝克曼公司），S-3400N扫描电镜（日本日立公司），Duo diagnost数字X光机（荷兰飞利浦公司），Med6.0病理数码图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司）。

1.5 动物实验方法 白兔正常饲料适应性饲养1周后，进行血管内支架植入术。成功后随机分成4组：裸支架组、CSA组、雷红冲剂组和CSA加雷红冲剂组。

药物治疗：血管内支架植入后，第1～5 d(冲击量)肌肉注射CSA 7.14 mg·kg-1·d-1。第6～14 d注射1.02 mg·kg-1·d-1。第15～28 d 0.678 mg·kg-1·d-1。雷红冲剂1 g/kg用生理盐水稀释成10 mL/kg，以备灌胃。

兔髂动脉造影：固定家兔，无菌条件下暴露并分离左下肢股动脉。穿刺注射100 mL含30 g碘的碘海醇注射液(造影剂)5～10 mL造影，显示左侧髂动脉及右侧含血管支架的髂动脉并保存图像。

取材：实验末麻醉处死家兔，无菌取出含血管支架的家兔髂动脉血管，包括上下相邻5 mm血管，一分为二。一部分用4%的多聚甲醛固定，经脱水、透明、石蜡包埋HE染色，免疫组化染色供镜检；另一部分用前固定液3%戊二醛固定2 h，磷酸缓冲液浸洗，冰箱中后固定，梯度脱水，供扫描电镜观察。

组织形态学观察及计算机图像分析：将获取的家兔髂动脉组织进行处理后分别切片作PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达检测，免疫组化染色及扫描电镜观察。

1.6 临床研究对象 选择下肢动脉闭塞性疾病患者80例，病程1个月～12个月，平均4.8个月。临床表现根据Fontaine分级标准，其中II级，表现为间歇性跛行者23例，III级，表现为静息疼者39例，IV级，表现为溃疡或坏疽者18例。随机分为两组。对照组40例，男28例，女12例；平均年龄（65.8±15.2）岁。雷红冲剂组40例，男27例，女13例；平均年龄（65.3± 14.6）岁。两组基本资料无显著性差异，具有可比性。

1.7 治疗方法 80例均行腔内治疗（球囊扩张、支架植入），给与皮下注射低分子肝素，5000 U/8 h 1次，连用5 d。口服硫酸氢氯吡格雷(玻立维)75 mg/d，持续6个月。终生口服阿司匹林100 mg/d。雷红冲剂组腔内治疗后，同时3次/d口服雷红冲剂，每次10 g，连续6个月。

1.8 观察指标 术前和术后4、12、24周分别于清晨空腹状态下抽取静脉血，测定血浆IL-10、IL-18水平，下肢动脉内-中膜厚度（IMT）和下肢动脉血管的通畅率。

2 结果

2.1 家兔髂动脉狭窄血管造影定量分析 各组家兔右髂动脉血管直径均有不同程度狭窄，以裸支架组明显，雷红冲剂组、CSA组和CSA加雷红冲剂组血管腔直径狭窄依次减轻。见表1。

表1 各组家兔髂动脉28 d血管造影结果(,n=6)

表1 各组家兔髂动脉28 d血管造影结果(,n=6)

注：裸支架组与CsA组比较，aP＜0.001；裸支架组与雷红冲剂组比较，bP＜0.001；裸支架组与CsA+雷红冲剂组比较，cP＜0.001

基础血管内径(mm)血管内支架植入后即刻内径(mm)血管内支架植入后即刻内径/基础内径28 d后血管内径(mm) 28 d后血管管径丢失(mm) 28 d后血管内径狭窄百分比（%）裸支架组2.46±0.02 2.87±0.02 1.17±0.01 1.21±0.05 1.25±0.03 51.4±1.69 CsA组2.48±0.15 2.90±0.01 1.17±0.01 2.17±0.03a0.27±0.02a10.9±0.71a雷红冲剂组2.47±0.03 2.88±0.02 1.16±0.02 1.96±0.04b0.51±0.04b21.3±1.89bCsA+雷红冲剂组2.48±0.02 2.89±0.01 1.16±0.01 2.21±0.03c0.26±0.08c10.1±3.09c

2.2 家兔髂动脉28 d后扫描电镜 裸支架组新生血管内膜表面血管内皮细胞排列相对紊乱，细胞的大小不一致，形态不一，细胞核不规则，细胞间隙较大(图1)。雷红冲剂组的血管内膜表面血管内皮细胞排列与裸支架组比较较规则、细胞的大小、形态、细胞核形态及细胞间隙等，明显好于裸支架组(图2)。环孢素组的新生血管内膜表面血管内皮细胞排列较规整、紧密，排列方向接近血流方向，细胞间隙较小，血管内皮细胞形态、大小相对一致，细胞核较规则，接近正常细胞间隙。血管内皮细胞比较接近正常血管内皮细胞，在细胞表面可见较多散在微绒毛结构(图3)。CSA加雷红冲剂组的新生血管内膜表面血管内皮细胞排列、细胞的大小、形态、细胞核形态及细胞间隙等，与CSA组大致相仿，但微绒毛结构沿细胞形态分布，而且分布更均匀说明细胞功能更接近正常血管内皮细胞(图4)。

图1 裸支架组扫描电镜（×2000）

图2 雷红冲剂组扫描电镜（×2000）

图3 CsA组扫描电镜（×2000）

图4 CsA组加雷红冲剂组电镜扫描电镜（×2000）

2.3 家兔髂动脉组织切片对PCNA、p21Cip1 蛋白表达的影响28 d后各组实验家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响结果见表2，各对比组家兔多个均数的比较单因素方差分析P值结果见表4。雷红冲剂组、CSA组及CSA加雷红冲剂组具有抑制PCNA蛋白表达、抑制CDK2蛋白表达、抑制VEGF蛋白表达、增加VSMC的p21Cip1蛋白表达的趋势。

表2 各实验组家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响的结果()

表2 各实验组家兔植入血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响的结果()

注：裸支架组与CsA组比较，aP＜0.001；裸支架组与雷红冲剂组比较，bP＜0.001；裸支架组与CsA+雷红冲剂组比较，cP＜0.001

组别裸支架组雷红冲剂组CsA CsA加雷红冲剂组例数(n) 6 6 6 6 PCNA 0.0906±0.0066 0.0566±0.0180 0.0319±0.0066 0.0306±0.0985 VEGF 0.0442±0.0178 0.0294±0.0119 0.0100±0.0026 0.0100±0.0019 CDK2 0.0690±0.0019 0.0409±0.0074 0.0319±0.0078 0.0305±0.0077c p21Cip1 0.0198±0.0034 0.0493±0.0127a0.0869±0.0076b0.0819±0.0056c

2.4 雷红冲剂对患者血浆中IL-10、IL-18水平及下肢动脉IMT的影响 雷红冲剂组IL-10、IL-18水平及IMT厚度均明显低于对照组，见表3。

2.5 雷红冲剂对血管通畅率的影响 两组腔内治疗成功率分别为98%和100%，血管通畅率随时间延长有不同程度的减低，对照组明显减低，雷红冲剂组无明显变化。随访24周，对照组的血管通畅率明显低于雷红冲剂组（P＜0.05）。见表4。

表3 雷红冲剂对患者血浆IL-10、IL-18水平及下肢动脉IMT的影响(,n=40)

表3 雷红冲剂对患者血浆IL-10、IL-18水平及下肢动脉IMT的影响(,n=40)

注：与对照组同期比较,aP＜0.01;与本组术前比较,bP＜0.01

组别对照组术前术后4周术后12周术后24周雷红冲剂组术前术后4周术后12周术后24周I L-10(pg/mL)I L-18(pg/mL)IMT(mm) 20.5±8.3 33.6±11.8b30.3±13.1 27.7±12.3 42.5±11.6 68.9±12.3b60.9±11.8 55.6±13.0 1.08±0.22 1.19±0.18b1.21±0.20 1.19±0.23 20.8±8.1 23.9±7.2a22.6±8.6a21.9±8.9a41.9±12.2 46.7±12.8a44.5±13.1a42.9±12.2a1.09±0.24 1.09±0.18a1.10±0.16a1.08±0.15a

表4 雷红冲剂不同时间对患者血管通畅率的影响(n,%)

3 讨论

3.1 免疫排斥反应对 ISR形成过程的影响ISR是多因素共同作用的结果，已有学者们提出了多种学说[3-4]，包括早期的血管弹性回缩、血小板聚集和附壁血栓形成、损伤血管局部炎症细胞(T淋巴细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞)浸润、新生内膜增殖和细胞外基质形成、血管壁的重塑等，但确切的因果关系尚未确定。本实验从家兔血管内支架植入术后家兔髂动脉狭窄血管造影定量分析、血管内支架植入家兔髂动脉28 d后扫描电镜比较、家兔血管内支架髂动脉组织切片对PCNA、VEGF、CDK2、p21Cip1蛋白表达影响等方面研究证明，CSA、雷红冲剂可以抑制细胞增殖的DNA合成、抑制调节细胞周期S期染色体DNA的复制、抑制调节细胞周期S期染色体DNA的复制、抑制免疫排斥反应的加重和炎细胞的浸润程度的增强、抑制细胞周期的进程及引起细胞G l、G2甚至S期的阻滞，进而推测CSA、雷红冲剂可以抑制及减缓ISR的发生。免疫抑制剂可有效预防家兔髂动脉血管内支架早期再狭窄，免疫抑制剂与雷红冲剂合用效果更佳。结果表明，免疫排斥反应参与了ISR形成过程，免疫排斥反应可能为引发ISR的重要机制之一。

3.2 雷红冲剂对ISR形成过程的影响 有文献报，道雷公藤、红花、甘草具有抗炎及免疫抑制作用[5]。本研究结果表明，雷红冲剂组血管内膜表面血管内皮细胞排列较裸支架组规则，细胞的大小、形态、细胞核形态及细胞间隙及血管通畅率等均明显好于裸支架组，雷红冲剂具有抑制PCNA蛋白表达、CDK2蛋白表达、VEGF蛋白表达及增加VSMC的p21Cip1蛋白表达的作用。说明雷红冲剂对ISR形成过程具有抑制作用。

3.3 雷红冲剂对下肢动脉腔内治疗后血管支架内再狭窄的作用 腔内治疗是目前下肢动脉闭塞性疾病的首选方法[6]。腔内治疗3年的通畅率在50%～70%范围，糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症的通畅率在42%～61%。腔内治疗后再狭窄或闭塞是目前血管外科急需解决的临床难题之一，而血管内膜增生是腔内治疗术后再狭窄的特征性病理改变[7]。病变血管的血管平滑肌细胞过度增殖并向内膜迁移是新生内膜增生的重要病理基础，是各种因素导致血管再通术后血管再狭窄的关键病理改变[8]。本文的临床观察结果表明，对照组腔内治疗后3个月后病变血管的通畅率降至72%，雷红冲剂治疗组为90%，雷红冲剂治疗组血浆中IL-10、IL-18的水平及IMT厚度均明显低于对照组，服药期间无明显不良反应。说明雷红冲剂对ISR形成过程具有抑制作用，有望作为干预下肢动脉腔内治疗后血管支架内再狭窄的药物。

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（收稿：2012-11-16 修回：2013-06-26）

（责任编辑 赵连根）

Effects of LeiHong（雷红）Granuleson Endovascular Treatment of Vascular Restenosis

HAN Bing,GE Chang-qing,ZHANG Hong-guang,et al. Department of Vascular Surgery,The Second Haspital of Baoding City,Baoding(071051),China

ObjectiveTo investigate the immune rejection involved in the formative process of intravascu⁃lar stent restenosis(ISR),and to observe the therapeutic effect of LeiHong granules（雷红冲剂）on in-stent reste⁃nosis of lower limb artery.MethodsTwenty-four healthy New Zealand white rabbits were implanted the met⁃al endovascular stent in the iliac arterys and were randomly divided into 4 groups:A:bare metal stent,B:Cyclo⁃sporin A(CSA),C:LeiHong capsule（雷红冲剂）,and D:CSA and LeiHong capsule（雷红冲剂）,the vessel diam⁃eter was recorded before the stent implantation,right after the implantation and 28 days later,with immunohisto⁃chemical staining and electronic microscopic observation,Eighty patients with lower extremity arterial occlusive disease were randomly divided into LeiHong（雷红）treatment group and control group with observation on changes of inflammation factors and vascular patency at different times.ResultsRabbit iliac artery ste⁃nosis rates were 51.4±1.69%（A），10.9±0.71%（B），21.3±1.89%（C）and 10.1±3.09%（D）.The patency rate of the lower extremity vessels in LeiHong granules（雷红冲剂）group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05),and the levels of IL-10,IL-18 and IMT in LeiHong granules（雷红冲剂）group were significantly lower(P＜0.01).ConclusionThe vascular in-stent restenosis can be intervened and inhibited by immuno⁃suppressants CSA and LeiHong granules（雷红冲剂）Immune rejection was one of the important causes for form⁃ing ISR propably.LeiHong granules（雷红冲剂）can effectively prevent from restenosis after endovascular treat⁃ment.

Immune rejection;in-stent restenosis;LeiHong granules（雷红冲剂）

Q95-33;R258.5

A

1007-6948(2013)05-0530-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.014

1.河北省保定市第二医院血管外科（保定 071051）

2.黑龙江中医药大学附属第一医院周围血管病科（哈尔滨 150000）

韩 冰，E-mail：hanbingmd@163.com