熊果酸和齐墩果酸D-苯甘氨酸缀合物的合成、表征及抗癌活性研究

房立杰，崔洪光，赵春晖，杨君微，王志伟，赵龙铉,,*

（1. 辽宁师范大学 化学化工学院，辽宁 大连 116029；2. 大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；3. 辽宁师范大学 生物技术与分子药物研发辽宁省重点实验室，辽宁 大连 116029）

熊果酸和齐墩果酸D-苯甘氨酸缀合物的合成、表征及抗癌活性研究

房立杰1，崔洪光2，赵春晖3，杨君微1，王志伟1，赵龙铉1,3,*

（1. 辽宁师范大学 化学化工学院，辽宁 大连 116029；2. 大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；3. 辽宁师范大学 生物技术与分子药物研发辽宁省重点实验室，辽宁 大连 116029）

熊果酸和齐墩果酸为同分异构体，同属五环三萜类化合物，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗炎、降糖、保肝、抗疟等生物活性。本文以具有一定生物活性的熊果酸和齐墩果酸为先导化合物，通过对它们C-28位甲酯化及C-3位导入D-苯甘氨酸，共设计合成了4种未见报道的熊果酸、齐墩果酸衍生物，利用IR和1H NMR波谱技术对其结构进行了表征。然后对目标产物进行了人神经胶质瘤U87ΔGEFR细胞和人肺癌细胞PC9/G体外抗癌活性测试。结果表明U-3对两种癌细胞的抑制作用明显优于熊果酸和齐墩果酸。

熊果酸；齐墩果酸；D-苯甘氨酸；抗癌活性；合成

0 引言

D-苯甘氨酸(D-Phenylglycine)及其衍生物是制备β-内酰胺类抗生素的重要中间体，常用于氨苄青霉素、头胞立新、头胞克罗以及头孢拉定等药品的制备，同时，它还是合成多肽激素、多种农药的重要中间体。由于它用途广泛，合成后的医药产品既可注射又可口服，所以在医药市场前景广阔[1]。熊果酸(Ursolic acid，简称UA)，又名乌苏酸，属于α-香树酯醇型五环三萜类化合物。主要存在于木犀科植物连翘、蔷薇科植物石楠叶等中。齐墩果酸(Oleanolic acid，简称 OA)，又名庆四素，属于齐墩果烷型五环三萜类化合物，在白花蛇舌草、女贞果实等植物中以游离形式存在或与糖结合成苷存在。五环三萜类化合物在自然界储量丰富，并由于其特殊的细胞毒性且本身毒性较低的原因，长期以来都受到科学家们的青睐。熊果酸和齐墩果酸具有多种药理活性，如抗肿瘤[2-3]、抗HIV[4]、抗炎[5]、降糖[6-7]、抗菌[8-9]、保肝[10-11]等多种生物活性。

虽然UA和OA药用开发前景广阔，但是对它们氨基酸缀合物的研究报道较少。为了研究和氨基酸缀合后的活性变化，我们分别以UA、OA为起始物，根据活性结构拼接原理，在其C-28位进行甲酯化，而后在C-3位引入苯甘氨酸，设计合成了UA和OA的苯甘氨酸缀合物。然后对目标产物进行了培养于DMEM的人神经胶质瘤U87GEFR△ 细胞和培养于RPMI-1640的人肺癌细胞PC9/G体外抗癌活性测试。合成路线如图1和图2所示。

图1 熊果酸苯甘氨酸缀合物的合成路线

图2 齐墩果酸苯甘氨酸缀合物的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

WGH-30双光束红外分光光度计，KBr压片；BRUKER-500MHz核磁共振仪，CDCl3为溶剂；X-5显微熔点测定仪(控温型)，温度未经校正。所用的试剂均为国产分析纯或化学纯。

细胞株：人神经胶质瘤U87ΔGEFR细胞和人肺癌细胞PC9/G。

1.2 熊果酸甲酯(U-1)的合成和表征

在250 mL圆底烧瓶中加入UA(5 g，11 mmol)和无水K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)，再加入干燥的DMF(50 mL)，搅拌下慢慢滴加CH3I(1.37 mL，21.89 mmol)，常温下搅拌 6 h，反应完毕后用水稀释，用1N的盐酸洗涤至微酸性，再用水洗至中性，并用饱和氯化钠洗涤，所得有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:5, V:V)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得白色固体U-1: 熊果酸甲酯。产量：4.9 g，产率：95.0%，熔点：170.0～172.5 ℃;IR(KBr): 3452, 2923, 1722, 1458 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 5.25(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 3.60(s, 3H, -OCH3), 3.20(dd, J=10.4 Hz, 5.2 Hz, 1H, H-3), 2.22(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.06, 1.00, 0.93, 0.92, 0.85, 0.78, 0.73(s, each 3H).

1.3 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基熊果酸甲酯(U-2)的合成和表征

在 100 mL圆底烧瓶中，将 U-1(400 mg，0.86 mmol)、Fmoc-D-phg-OH(382 mg，1.02 mmol)、DMAP (124 mg，1.02 mmol)溶于CH2Cl2(7 mL)中，将反应液冷却到0 ℃，再将EDCI(197 mg，1.02 mmol)溶于CH2Cl2(3mL)中，在搅拌下逐滴加入反应瓶中，滴加完毕后在0 ℃条件下搅拌5 min，然后在室温下搅拌5 h，反应完毕后，用CH2Cl2提取，并用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:10, V:V)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得白色固体U-2: 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基熊果酸甲酯。产量：620 mg，产率：70.1%，熔点：114.6-116.5 ℃; IR(KBr): 3348, 2931, 1722, 1564, 1452 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.76(d, J=7.5 Hz, 2H, Fluorenyl H-4 & H-5), 7.58(d, J=6.2 Hz, 2H, Fluorenyl H-1 & H-8), 7.41-7.30 (m, 9H, Fluorenyl H-2 & H-3 & H-6 & H-7, 5×Ph-H), 5.99(d, J=6.8 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.32(d, J=7.1 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.57-4.48 (m, 1H, H-3), 4.39-4.38(m, 2H, -CHCH2OCONH-), 4.22-4.20(m, 1H, Fluorenyl H-9), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.22(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.4 3-O-苯甘氨酰基熊果酸甲酯(U-3)的合成和表征

在 100 mL圆底烧瓶中，将 U-2(200 mg，0.24 mmol)溶于CH2Cl2(5 mL)中，再加入二乙胺(5 mL)，常温下搅拌2 h，反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂得粗产品，再用乙酸乙酯/石油醚(1:2, V:V)作洗脱剂进行加压柱层析，分离得白色固体U-3: 3-O-苯甘氨酰基熊果酸甲酯。产量：128 mg，产率：88.3%，熔点：48.2～54.7 ℃; IR(KBr): 3447, 2937, 1731, 1581, 1436 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.40-7.25(m, 5H, 5×Ph-H), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.60(d, J=13.5 Hz, 1H, H2NCHOCO), 4.45-4.52(m, 1H, H-3), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.24(d, J=11.2 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.5 齐墩果酸甲酯(O-1)的合成和表征

按照合成U-1的实验方法由化合物OA(5 g，11 mmol)反应得到白色固体O-1: 齐墩果酸甲酯。产量：5 g，产率：97.0%，熔点：197.0～198.0 ℃;IR(KBr): 3348, 2948, 1728, 1426 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 5.27(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 3.61(s, 3H, -OCH3), 3.20 (dd, J=10.4 Hz, 5.2Hz, 1H, H-3), 2.85(dd, J=14.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, H-18), 1.06, 1.00, 0.92, 0.78, 0.73(s, each 3H).

1.6 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯(O-2)的合成和表征

按照合成U-2的实验方法由化合物O-1(500 mg，1.07 mmol)、Fmoc-D-phg-OH(595 mg，1.59 mmol)反应得到了白色固体 O-2: 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯。产量：520 mg，产率：73.7%，熔点：115.4～118.7 ℃; IR(KBr): 3340, 2922, 1730, 1577, 1472 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.76(d, J=7.5 Hz, 2H, Fluorenyl H-4 & H-5), 7.58(d, J=6.2 Hz, 2H, Fluorenyl H-1 & H-8), 7.41-7.30(m, 9H, Fluorenyl H-2 & H-7 & H-6 & H-3, 5×Ph-H), 5.99(d, J=6.8 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.32(d, J=7.1 Hz, 1H, -CH-NH-CO), 5.25(t, J=3.5 Hz, 1H, H-12), 4.57-4.48(m, 1H, H-3), 4.39-4.37(m, 2H, -CHCH2OCONH-), 4.21-4.19(m, 1H, Fluorenyl H-9), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.85(dd, J=14.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, H-18), 1.08, 0.95, 0.93, 0.87, 0.75, 0.67, 0.48(s, each 3H).

1.7 3-O-苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯(O-3)的合成和表征

按照合成U-3的实验方法由化合物O-2 (200 mg，0.24 mmol)反应得到白色固体 O-3: 3-O-苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯。产量：105 mg，产率：71.6%，熔点：194.6～196.8 ℃；IR(KBr): 3444, 2935, 1729, 1530, 1460cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3): 7.39-7.27(m, 5H, 5×Ph-H), 5.25(t, J=3.6 Hz, 1H, H-12), 4.60(d, J=13.9 Hz, 1H, NH2CHOCO), 4.52-4.45(m, 1H, H-3), 3.60(s, 3H, -OCH3), 2.85(dd, J=13.9 Hz, 4.0 Hz, 1H, 4.2 Hz, H-18), 1.12, 0.98, 0.89, 0.87, 0.70, 0.63, 0.44(s, each 3H);

2 熊果酸、齐墩果酸苯甘氨酸缀合物的抗癌活性测试

2.1 细胞培养

将人神经胶质瘤U87 GEFR△ 细胞和人肺癌细胞PC9/G分别培养于DMEM和RPMI-1640，培养基内含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素。细胞培养的条件：控制温度为37 ℃、5%CO2培养箱内。

2.2 抗肿瘤实验

水溶性四唑盐WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量呈正比。各类药物由适量DMSO溶解，并由细胞培养液稀释成实验所需梯度浓度。

取对数生长期的细胞制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，按每孔100 μL将细胞悬液铺于96孔板，设定无药对照孔和空白对照孔，培养24 h后，吸去孔中培养液，各孔分别加入配制好的相应浓度的药物100 μL。继续孵育48 h，吸去孔中培养液，每孔加入10 μL CCK-8溶液。将96孔板在培养箱孵育一段适当的时间，用酶标仪检测在450 nm处的吸光度。实验设药物处理组、阴性对照组(不加药物的细胞悬液)和空白对照组(只加培养液)。每组实验结束后，计算细胞存活率，并根据细胞存活率绘制耐药曲线，得到致半数细胞死亡的药物浓度(半数致死浓度，IC50)值。

细胞存活率=(加药孔A值-空白对照孔A值)／(细胞对照空A值-空白对照孔A值)×100%。

2.3 实验结果

我们通过对所合成的目标化合物进行抗癌活性测试，计算细胞存活率，并根据细胞存活率绘制耐药曲线，得到致半数细胞死亡的药物浓度(半数致死浓度，IC50)值。所合成的目标化合物对 U87ΔGEFR、PC9/G细胞半数抑制浓度对照结果如表1所示。

表1 化合物对U87ΔGEFR、PC9/G细胞半数抑制浓度对照

3 结果与讨论

我们做了以下工作：(1)首先以熊果酸和齐墩果酸为起始原料，分别在熊果酸和齐墩果酸C-28位引入甲基，在DMF溶剂中，无水K2CO3作用下与CH3I反应分别得到熊果酸甲酯和齐墩果酸甲酯。（2）在CH2Cl2溶剂中，DMAP和 EDCI作用下与Fmoc-D-phg-OH反应分别得到 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基熊果酸甲酯和 3-O-(N-芴甲氧羰基)苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯。（3）在CH2Cl2溶剂中，二乙胺作用下分别得到 3-O-苯甘氨酰基熊果酸甲酯和3-O-苯甘氨酰基齐墩果酸甲酯。

抗癌实验结果显示，先导化合物UA和OA对神经胶质瘤U87 GEFR△ 细胞和人肺癌细胞PC9/G均有一定的抑制作用，缀合物 O-2、O-3、U-2对两种癌细胞的抑制作用不明显，缀合物U-3对两种癌细胞的抑制作用明显优于熊果酸。

4 结论

本文以熊果酸和齐墩果酸为起始物，通过对其C-28位甲酯化及C-3位引入苯甘氨酸，合成了4种未见文献报道的熊果酸和齐墩果酸苯甘氨酸缀合物，采用IR、1H NMR对其进行了结构表征。并且，本文对所合成的熊果酸和齐墩果酸苯甘氨酸缀合物进行了体外抗癌活性研究，抗癌实验结果表明先导化合物UA和OA对神经胶质瘤U87 GEFR△ 细胞和人肺癌细胞PC9/G均有一定的抑制作用，缀合物U-3对两种癌细胞的抑制作用明显优于熊果酸和齐墩果酸。

[1] 徐亚荣. 苯甘氨酸、对氯苯甘氨酸合成工艺的研究[D]. 南京: 南京工业大学, 2008.

[2] HSU H Y, YANG J J, LIN C C. Effect of oleanolic acid inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system post irradiation in Mice [J]. Cancer Lett, 1997, 111(1-2): 7-13.

[3] OVESNA Z, VACHALKOVA A, HORVATHOVA, K, et al. Pentacyclic triterpenoic acids; new chemoprotective compounds [J]. Minireview Neoplasma, 2004, 51(5): 327-333.

[4] MA C, NAKAMURA N, MIYASHIRO H, et al. Inhibitory effects of constituents from cynomorium songaricum and related triterpene derivatives on HIV-1 protease [J]. Chem. Pharm. Bull, 1999, 47(2): 141-145.

[5] CAI L, WU C D. Compounds from syzygim aromaticum growth inhibitory activity against oral pathogens [J]. J Nat Prod, 1996, 59(10): 987-990.

[6] 郝志奇, 杭秉茜. 齐墩果酸对小鼠的降糖作用[J]. 中国中医药杂志, 2002, 27(12): 221-222.

[7] YOSHIKAWA M, MATSUDA H. Antidiabetogenic activity of oleanolic acid glycosides from medicinal foodstuffs [J]. Biofactor, 2000, 13(1-4): 231-237.

[8] 庞劲松, 于倩, 刘宝, 等. 尾叶香茶菜化学成分及药理作用的研究[J]. 东北师范大学学报: 自然科学版, 2005, 37(4): 94-98.

[9] 田奇伟, 唐绍海, 郭成立,等. 木瓜的抗菌作用[J]. 微生物学通报, 1982, (16): 271-272.

[10] JEONG H G. Inhibition of cytochrone P450 2El expression by oleanolic acid: hepatoprotective effects against carbon tetrachloride-induced hepatic injury [J]. Toxicol Lett, 1999, 105(3): 215-222.

[11] HAFFAJEE A D, SOCRANSKY S S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases [J]. Periodonotol 2000, 1994, 5(1): 78-111.

Synthesis and Characterization of D-phenylglycine Conjugates of Ursolic Acid and Oleanolic Acid, and the Study on the Anticancer Activity

FANG Li-jie1, CUI Hong-guang2, ZHAO Chun-hui3, YANG Jun-wei1, WANG Zhi-wei1, ZHAO Long-xuan1,3,*
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China; 3. Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China）

Ursolic acid and oleanolic acid are isomers and they both belong to the compound of pentacyclic triterpenoids. They show many biological activities, such as anti-tumor, anti-HIV, anti-inflammatory, hypoglycemic, hepatoprotective, antimalarial and many other kinds of pharmacological effects. We take the natural product ursolic acid and oleanolic acid which with biological activity as the lead compounds for modifying their structures in this paper, four novel ursolic acid and oleanolic acid derivatives were designed and synthesized through methyl esterification at C-28 of ursolic acid and oleanolic acid , and introducing D-phenylglycine at C-3. Structures of all target compounds were confirmed by IR and 1H NMR. These compounds were tested anticancer activity, which were human glioma cell U87△GEFR and human lung cancer cells PC9/G. The results showed that U-3 displayed higher inhibitory activity than ursolic acid and oleanolic acid for these two kinds of cancer cells.

ursolic acid; oleanolic acid; D-phenylglycine; anticancer activity; synthesis

O624.33

：A

：1008-2395(2013)06-0028-04

2013-09-04

房立杰（1988-），女，硕士研究生，研究方向：药物合成。

赵龙铉（1967-），男，教授，研究方向：药物合成。