ACE/DD基因型和MYH7突变与原发性高血压左室肥厚的关系

郭军霞，高东升，甘立军，代玉川，李传方

（1.山东大学医学院，山东济南 250012;2.济宁医学院附属医院心内科，山东济宁 272029）

左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）是高血压最常损害的的靶器官之一，其发生率为30% ～40%，目前认为高血压LVH是心血管病事件的独立危险因素［1］。在研究高血压LVH的病因中，发现肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）系统中ACE基因DD基因型与LVH有着密切的关系［2］，但是国内外研究较多的是单个基因与高血压LVH的关系，联合基因作用与LVH相关性的报道极少。β-肌球蛋白重链基因（beta-myosin heavy chain gene，MYH7）位于14号染色体1区1带和2带之间，编码肌球蛋白，目前MYH7基因已发现160多种不同突变类型，临床上主要导致心室肌肥厚，甚至猝死等恶性事件［3］。遗传学研究表明原发性高血压为多基因病，其靶器官损害也可能是多基因共同参与的过程，本研究利用联合作用进一步探索高血压LVH的候选基因，从遗传学角度防治高血压靶器官损害。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取203例原发性高血压患者来自2011年6月至2012年2月济宁医学院附属医院心内科住院患者，100例非高血压者为济宁医学院附属医院健康查体者，其中男151例，女152例，平均年龄（59.9±12.1）岁。根据2010年版中国高血压防治指南，高血压患者入选标准诊室测量血压收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），除外继发高血压、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心脏瓣膜病、心力衰竭、恶性肿瘤、免疫疾病、感染、创伤、肝肾功能衰竭、服用免疫抑制剂、细胞毒性药物、激素替代治疗的患者，纳入标准的患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床表型测定:测所有受试者血压、身高、体质量，计算体质指数（BMI）和体表面积（BSA）。清晨空腹抽取静脉血，测定一般生化指标（肝、肾功能，血脂、血糖）。

1.2.2 左心室肥厚测定:采用荷兰飞利浦IE33型号彩色多普勒超声诊断仪，探头频率2.5 MHz，M型超声心动图测量左心室长轴腱索水平测量左心室舒张末期内径（LVDd）、室间隔厚度（IVSd）、左心室后壁厚度（LVPWd）。连测3～5个心动周期，取其平均值，根据 Devereux公式计算左室重量（LVM），LVM（g）=1.04×［（LVDd+IVSd+LVPWd）3－LVDd3］－13.6;左室重量指数（LVMI）（g/m2）=LVM/BSA，体表面积（BSA）=［0.006×身高（cm）+0.0128×体质量（kg）］－0.1529。左心室肥厚诊断标准根据2010年版中国高血压防治指南推荐标准，左心室肥厚标准 LVMI＞125 g/m2（男），＞120 g/m2（女）［4］。

1.2.3 基因型检测:抽取外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，应用全血基因组DNA提取试剂盒法（离心柱型）（天根生化科技有限公司，试剂盒批号:DP110413）提取DNA。

1.2.4 ACE基因I/D多态性的检测:应用PCR扩增ACE基因第16内含子目的片段，引物参照文献［5］设计:正向 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTC T-3'，反向 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'（由上海生物工程有限公司合成）。PCR反应:95℃预变性3 min，95℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸40 s，35个循环后，最后72℃延伸7 min。扩增产物加样于3%的琼脂糖凝胶板上，在100 V电压下电泳30 min，紫外灯下观察结果（图1），约190和490 bp处可见各自基因型条带，随机抽取各型PCR产物进行测序（由上海生物工程有限公司完成，图2）。

图1 ACE基因型检测电泳图Fig 1 Electrophoresis figure testing of ACE genetype

1.2.5 MYH7基因突变的检测:应用PCR扩增MYH7基因第20外显子目的片段，引物:正向5'-CATGG GTGACTCTGGACACTT-3'，反向 5'-AGTCTCCTTTCC TCACCTTGG-3'（由上海生物工程有限公司合成）。PCR反应95℃预变性3 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环后，最后72℃延伸7 min。PCR产物经电泳检测扩增成功（图3），采用双脱氧末端终止法进行测序反应（由上海生物工程有限公司完成）（图4）。

图2 ACE基因型测序图Fig 2 Sequencing diagram of ACE genetype

图3 MYH7基因PCR扩增产物Fig 3 PCR amplification product of MYH7 gene

1.3 统计学分析

应用SPSS13.0软件进行数据统计学分析。所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，遗传平衡检验采用Hardy-Weinberg平衡定律，各分组间临床特点比较用独立样本t检验或单因素方差分析，各组间基因分型特点采用χ2检验分析。

2 结果

2.1 各组间临床资料的比较

高血压 LVH组（EH-LVH）、高血压非 LVH（EH-NLVH）和对照组（control）。3组的年龄（age）、体质量（BW）、体重指数（BMI）、谷丙转氨酶（ALT）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）和肌酐（Cr）均无显著差异性。EH-LVH组、EH-NLVH组的收缩压、舒张压显著高于control组（P＜0.01）（表1）。

图4 MYH7基因测序图Fig 4 Sequencing diagram of MYH7 gene

2.2 基因型频率及等位基因频率

EH-NLVH组和control组基因型II、DD和ID频率以及等位基因I、D分布符合Hardy-Wenibegr遗传平衡定律，具有群体代表性。在高血压患者中，A、B两组基因型及等位基因频率比较具有显著差异（P＜0.01）（表2）。

表1 各组间临床指标比较Table 1 The comparison between clinical index（±s）

表1 各组间临床指标比较Table 1 The comparison between clinical index（±s）

*P ＜0.01 compared with control group.

index EH-LVH（n=102）EH-NLVH（n=101）control（n=100）age（years）60.6±12.4 61.5±10.3 57.6±13.3 BW（kg） 69.8±13.6 68.3±11.1 64.3±11.7 BMI（kg/m2） 25.8±6.7 24.9±7.2 24.9±6.7 ALT（U/L） 34±39 28±35 25±24 LDL（mmol/L） 2.8±0.8 2.7±0.8 2.7±0.9 FBG（mmol/L） 5.7±2.4 5.6±1.4 5.4±1.7 Cr（mmol/L） 55.0±34.5 52.7±48.7 45.1±14.5 SBP（mmHg） 145±25* 137±20* 120±11.7 DBP（mmHg） 88±18* 83±12*76±8

表2 各组ACE/ID基因型频率和等位基因频率分布比较Table 2 The comparison between ACE/ID genotype frequency and allele frequency distribution comparison（±s，%）

表2 各组ACE/ID基因型频率和等位基因频率分布比较Table 2 The comparison between ACE/ID genotype frequency and allele frequency distribution comparison（±s，%）

*P ＜0.01 compared with EH-NLVH group.

genotype frequency allele frequency group n DD ID II I D EH-LVH 10232（31.4）*49（48.0）*21（20.6）* 91（44.6） 113（55.4）EH-NLVH 10114（13.9） 37（36.6） 50（49.5） 137（67.8） 65（32.2）control 10012（12.0） 39（39.0） 49（49.0） 137（68.5） 63（31.5）

2.3 肌小节蛋白基因突变的分析

经基因序列对比，3组中均未发现MYH7基因突变。

3 讨论

在左心室肥厚形成的过程中有许多因素参与其中，主要分为血流动力学和非血流动力学。其中，遗传因素在非血流动力学中具有重要作用。本研究采用联合分析研究ACE基因I/D多态性和MYH7基因突变与高血压LVH的相关性。若具有相关性，MYH7基因的突变可作为LVH遗传易感性基因。到目前为止，ACE基因是研究较多的候选基因，因该基因的第16内含子存在一段287 bp的Alu序列插入与缺失而呈现多态性，即I/D多态性。国内外研究中，发现该基因型与高血压LVH的研究结果存在差异性［6－7］。近年来多数研究认为，DD基因型高血压患者易发生左心室肥厚。

高血压LVH和肥厚性心肌病引起的LVH虽发病原因不大相同，但病理组织学［8］极为相似，且都有基因遗传学的作用参与。在肥厚性心肌病的遗传学研究中，突变率较高的是MYH7基因，编码β肌凝蛋白（β-MHC）重链。有研究在做基因筛查时发现MYH7基因第20外显子突变外显率高，发病年龄、临床症状出现较晚［9］。近年来发现ACE/DD基因型修饰肥厚型心肌病的临床表型，及DD基因型的肥厚型心肌病患者左心室重量指数大于ID型和Ⅱ型患者［10］。国内外研究中，本研究首次分析了MYH7基因突变与ACE基因多态性联合分析与高血压LVH的关系，在所有研究对象中未发现MYH7基因突变，通过关联分析未发现MYH7基因突变与ACE/DD基因型之间有协同作用。本研究阴性结果的原因可能有:1）MYH7基因与高血压LVH确实无关或存在遗传异质性;2）存在地区、种族的差异性;3）需进一步扩大收集样本。

MYH7基因突变与ACE/DD基因型和高血压LVH的关系尚需进一步探讨。通过人群中LVH发生的危险性进行遗传学分析研究，可以尽早判断发生LVH的危险，对其进行早期干预和治疗，从而阻止发病和靶器官的损害，进一步为高血压的干预治疗提供可靠的依据。

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