G蛋白偶联受体激酶4突变A142V基因对大鼠血管平滑肌细胞AT1受体的影响＊

邓 昆，刘 莉，陈彩宇，陈 垦，王 微，周永巧，何多芬，曾春雨△

（1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科／重庆心血管病研究所，重庆400042；2.77263部队医院，云南大理671000）

原发性高血压（esesntalihypertension，EH）是冠心病、糖尿病肾病以及脑梗死等的重要危险因素。EH的发生和遗传因素密切相关，与EH基因连锁的G蛋白偶联受体激酶4（GRK4）也因此受到越来越多的关注。GRK4是GRKs的一种，在GRKs的几个亚型中，只有GRK4的改变先于高血压的发生而发生［1-2］，其变异体A142V和EH的发生密切相关［3］。肾素血管紧张素（RAS）系统激活参与动脉粥样硬化的形成，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是整个RAS系统最重要的因子之一，血管紧张素Ⅱ1型（AT1）受体是AngⅡ的主要作用受体，其介导的血管平滑肌细胞（VMSCs）增殖是动脉粥样硬化、术后血管再狭窄共同的病理基础［4］。既往的研究发现转染GRK4γA142V基因的小鼠GRK4升高的同时血压明显升高［1］，Yatabe等［5］发现在肾脏组织 AT1受体伴随 GRK4的改变而发生改变，本实验室以往研究发现人和大鼠的血管上有GRK4的表达，作者推测血管组织GRK4对AT1受体也有重要的调控作用。因此，本研究以转染hGRK4γWT和hGRK4γA142V的A10细胞为研究对象，检测这两种细胞中AT1受体的改变和细胞增殖的变化，以探索hGRK4γA142V如何影响RAS系统而引起VSMCs异常增殖导致EH的发生。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠胸主动脉平滑肌细胞株（A10），hGRK4γWT和hGRK4γA142V质粒由美国马里兰大学Dr Pedro A Jose实验室惠赠，DMEM高糖型培养基，FBS胎牛血清购自美国GIBCO公司；AngⅡ购自美国Sigma公司；GRK4活性测定试剂盒购自上海杰美公司；兔抗AT1R、兔抗β-actin一抗购自美国Santa Cruz公司；磷酸化苏氨酸抗体购自美国cell signaling technology公司；［3H］胸腺嘧啶试剂盒购自北京原子能研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒载体的构建、病毒的生产包装及转染 将hGRK4γWT质粒、hGRK4γA142V质粒和绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆至慢病毒表达载体，利用lipofectamineTM2000脂质体转染试剂将慢病毒包装质粒混合物与包含hGRK4γWT、hGRK4γA142V的表达载体共转染至病毒生产细胞系293TN，48h后收集上清液，使用0.45μm滤膜过滤上清液，由此包装、生产出携带GRK4γWT、GRK4γA142V基因的重组慢病毒 （Lv-GRK4γWT-EGFP 和 Lv-GRK4γA142V-EGFP），收集上清液，以MOI值为10感染A10细胞。

1.2.2 荧光共聚焦显微镜下观察EGFP表达 hGRK4γWT和hGRK4γA142V细胞均匀接种于6孔培养板中（内置盖玻片），置37℃5%CO2培养箱中培养至第3天，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，取细胞爬片置荧光共聚焦显微镜下观察。

1.2.3 免疫印迹检测AT1受体 常规方法提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。将50μg变性好的蛋白进行SDS-PAGE电泳，利用半干转移法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭1h，与GRK4抗体，AT1受体抗体（1∶400）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10min，羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育1h，TBST洗涤3次×10min，利用增敏化学发光法，经X线片曝光、显影、定影。结果经光密度面积分析，与内参照β-actin产物条带的比值作为相对浓度。

1.2.4 分光光度法检测GRK4活性 提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。65μL缓冲液，10μL酶促液，10 μL反应液，10μL底物液于30℃培养箱里静置3min，加入50 μg蛋白，阴性对照加入5μL阴性液作为背景对照，用分光光度法测定，以每微克总蛋白中GRK4每分钟NADH转化为NAD的量表示。

1.2.5 ［3H］胸腺嘧啶的掺入试验将hGRK4γWT 和hGRK4γA142V细胞制成单细胞悬液，计数后将细胞浓度调整为3×104个／mL，按1mL／孔接种于24孔培养板，置37℃、5%CO2培养箱中培养48h，然后换等量的无血清培养液培养2h，然后向每孔中加入［3H］胸腺嘧啶0.3mCi继续培养6h，吸去含游离［3H］胸腺嘧啶的培养液，用0.25%胰酶消化细胞，真空抽滤法将细胞收集于玻璃纤维滤膜，依次用PBS、10%三氯乙酸及无水乙醇冲洗，抽干后于80℃、30min烤干，置液闪杯中，加入5mL液体闪烁液，静置平衡过夜，在液闪仪上计数每分钟的值，以3×104细胞表示［3H］胸腺嘧啶的掺入率［4，6］。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0软件分析。计量资料以±s表示，两组间采用t检验，两组以上的比较采用ANOVA法进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hGRK4γWT和hGRK4γA142V转基因细胞的建立及蛋白鉴定 构建了野生型GRK4wild-IRES2-EGFP表达载体和突变体GRK4A142V-IRES2-EGFP表达载体，慢病毒以MOI值为10感染A10细胞。荧光显微镜下观察，两种细胞均可见90%细胞细胞质内表达EGFP，呈绿色荧光，提示病毒成功转染细胞，携带基因的蛋白表达。见图1。

图1 荧光显微镜下观察转染细胞的绿色荧光（×200）

2.2 hGRK4γA142V转基因细胞GRK4活性的改变 结果显示，hGRK4γA142V细胞的GRK4酶活性显著升高。见图2。

图2 hGRK4γA142V转染A10细胞GRK4活性的改变

2.3 hGRK4γA142V转基因细胞AT1受体的改变 免疫印迹显示A10细胞转染hGRK4γA142V基因后，AT1受体表达显著升高。见图3。

图3 hGRK4γA142V转染A10细胞AT1受体表达的改变

2.4 hGRK4γA142V转基因细胞GRK4和AT1受体共连接的改变 免疫沉淀显示，GRK4和AT1受体间存在共连接作用，hGRK4γA142V转基因细胞GRK4和AT1受体的共连接作用明显减弱，这种共连接的改变可能参与了GRK4对AT1受体的调节作用。见图4。

图4 hGRK4γA142V转基因细胞GRK4和AT1共连接的改变

2.5 AngⅡ刺激转染hGRK4γA142V转基因细胞增殖效应的改变 采用［3H］胸腺嘧啶掺入法测定细胞增殖，结果显示AngⅡ刺激hGRK4γA142V细胞引起细胞增殖幅度明显高于刺激hGRK4γWT细胞，见图5。

图5 AngⅡ刺激hGRK4γA142V转基因细胞引起增殖效应改变

3 讨 论

RAS在调节血管张力及钠水平衡方面发挥了重要作用。AngⅡ作为RAS系统中最主要的生物活性物质，其和AT1受体结合后介导了细胞增殖、肾近曲小管细胞尿钠转运，与AT2受体结合则发挥相反的作用。高血压状态下AT1受体的功能增加，其发生的原因目前尚不明了。GRKs是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，共7个亚型，其主要生理功能是磷酸化GPCR，使GPCR介导的信号通路失敏，在这7个亚型中只有GRK4的改变先于高血压的发生。GRK4基因所在的染色体部位（4p16.3）与EH的发生关系密切，其基因变异体也和EH的发生密切相关［6］。人的 GRK4有α、β、γ、δ4种异构体，γ异构体的3个突变位点A142V、A486V、R65L可以引起GRK4活性升高和EH密切相关，所以γ亚基成为本研究关注的焦点［7］。Jose等［8］发现在3个突变体中只有A142V转基因小鼠在正常盐饮食的情况下可以发生高血压，他们还发现在携带A142V突变基因的日本高血压患者中，服用血管紧张素受体阻断剂（ARB），血压出现显著性降低，A142V转基因小鼠服用ARB后血压恢复正常。这提示GRK4γA142V突变引起的血压升高和RAS系统及AT1受体有密切联系。

既往研究发现人的GRK4存在于睾丸、肾脏和脑组织中［9］，而本实验室首次发现VSMCs中有GRK4表达。在肾脏组织GRK4和AT1受体有密切关系，那么在血管组织中，GRK4是否也调节AT1受体的表达及其介导的平滑肌细胞增殖。本研究转染hGRK4γA142V到 A10细胞中，观察到GRK4活性显著升高，这种现象证实hGRK4γA142V可以使GRK4的活性增强。AT1受体作为GPCRs的一种，Zheng等［10］发现hGRK4γA142V转基因小鼠肾脏AT1受体表达升高，在血管中，GRK4是否具有相同的效应，本研究结果显示hGRK4γA142V细胞中AT1受体的表达显著升高。推测这种活性的增强引起的AT1受体表达的改变参与了高血压的发生、发展。作者还发现转染hGRK4γA142V可导致GRK4和AT1受体的共连接降低，推测GRK4和AT1受体的共连接程度减少导致GRK4和AT1受体偶联减少，而这种偶联的减少可能与AT1受体磷酸化的改变相关。

据以往报道，AT1受体具有自发活性，当AngⅡ刺激时AT1受体的活性明显增强［11-12］，在血管中AT1受体介导的VSMCs的异常增殖是血管壁增厚和硬化的主要病理、生理基础［13］。本研究结果显示，AngⅡ刺激后转染hGRK4γA142V细胞的增殖效应明显高于转染hGRK4γWT细胞，在没有AngⅡ刺激的状态下转染hGRK4γA142V细胞的增殖效应仍然明显高于转染hGRK4γWT细胞。

综上所述，hGRK4γA142V通过影响的VSMCs AT1受体表达，从而影响AT1受体介导的VSMCs增殖，在心血管系统疾病的病理、生理过程中具有重要意义。

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