AcSDKP对硅肺纤维化大鼠胶原含量及NF-κB p65表达的影响＊

闫静波

（河北省邢台市人民医院病理科 054001）

硅肺是一种常见的职业病，其病变以硅结节形成和广泛的肺纤维化为特征［1］。N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）是一种生理性造血系统生长抑制因子［2］。AcSDKP对多器官内的多种类型细胞的增殖、细胞外基质代谢和血管形成等方面有重要的调节作用。它能抑制心脏和肾脏间质成纤维细胞及肾小球系膜细胞的增殖，减少胶原的沉积，对高血压及心肌梗死后心脏和肾脏纤维化有一定的抑制作用［3-5］。核转录因子-κB（NF-κB）是2个亚单位p50和p65组成的异源二聚体，NF-κB参与许多前炎症介质分子转录水平的调控，促进细胞因子、黏附分子、趋化因子、炎症因子、氧化应激相关酶等大量释放［6］。本研究观察了AcSDKP对硅肺纤维化大鼠胶原合成和NF-κB p65的影响，借以探索NF-κB p65在硅肺纤维化发病机制中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体质量180g，购于北京维通利华动物公司；AcSDKP购于瑞士Bachem AG公司；标准α石英粉尘（微粒直径小于5μm）购于中国预防医学科学院；药物释放泵购于美国Alzet公司；VG试剂盒购于福州迈新生物工程公司；羟脯氨酸测试盒购于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠NF-κB p65抗体购于武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 选用非暴露式气管插管灌注法制作大鼠硅肺模型，并给予AcSDKP治疗。60只清洁级健康成年雄性Wistar大鼠分为3组，（1）对照组：每只支气管内灌注生理盐水1.0mL，8周后处死；（2）硅肺模型组：每只大鼠支气管内灌注SiO250mg／mL，8周后处死；（3）治疗组：每只大鼠支气管内灌注SiO250mg／mL，持续给予 AcSDKP 800μg·kg-1·d-1治疗，8周后处死。各组大鼠分别于处理后相应时间点处死。取右下叶肺组织4%多聚甲醛固定、脱水后常规石蜡包埋，4μm连续切片，做HE染色、胶原VG染色和NF-κB p65免疫组化，取右中叶肺组织做胶原羟脯氨酸测定，取右上叶肺组织采用蛋白免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白表达。

1.2.2 HE染色 HE染色后观察各组大鼠肺组织内硅结节的形成与大小。用图像分析仪系统测定每只大鼠每张切片随机选择5个200倍视野下，硅结节切面总面积占该视野总面积的百分比来半定量硅结节的大小。

1.2.3 胶原VG染色 观察各组大鼠肺组织内胶原纤维的形成及变化特点，进行胶原半定量分析。染色严格按照试剂盒操作说明进行。用图像分析仪系统测定每只大鼠每张切片5个200倍视野下VG阳性染色的积分光密度值（integral optical density，IOD）来半定量肺内胶原的含量。

1.2.4 胶原羟脯氨酸测定 测定组织羟脯氨酸的含量，可换算成胶原蛋白的含量，以反映实验各组纤维化程度。采用对二甲氨基苯甲醛显色法检测肺组织羟脯氨酸含量，实验步骤严格按照羟脯氨酸测试盒说明书进行操作。

1.2.5 NF-κB p65免疫组化染色 一抗为兔抗大鼠 NF-κB p65抗体，工作浓度1∶100，二抗为羊抗兔，采用SABC法DAB显色。实验严格按照试剂盒操作说明进行。每张切片随机选择5个视野，在高倍光镜下（×400）用图像分析仪测定大鼠肺组织阳性细胞的平均百分数。

1.2.6 NF-κB p65蛋白迹印法 提取大鼠肺组织蛋白，参照蛋白标准曲线进行蛋白含量测定，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移把凝胶内的样品蛋白转移到硝酸纤维膜上，5%BSA常温振荡封闭1h，一抗体（NF-κB抗体），4℃过夜，二抗，室温1h，加入碱性磷酸酶显色剂显色约20min，将NC膜用扫描仪对蛋白表达条带进行灰度扫描，经自动图像分析系统进行半定量分析，以对照组的平均光密度值（OD值）为1，其他各组与对照组相比取值。

1.3 统计学处理 用SPSS12.0进行统计分析，各组间采用完全随机设计的单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体观察 （1）对照组双肺粉红，弹性良好，表面光滑。（2）硅肺模型组双肺苍白，表面可见散在灰白色结节，触之略有砂粒感。（3）治疗组双肺颜色浅红，弹性尚好，表面的灰白色的结节比硅肺模型组减少。

2.2 HE染色观察 （1）对照组大鼠双肺结构清晰，肺泡壁薄，间质无明显炎细胞浸润。（2）硅肺模型组大鼠肺组织内可见局灶性间质性炎症，以巨噬细胞和淋巴细胞渗出浸润为主。肺泡间隔水肿增宽，肺组织内见纤维细胞性结节，并出现结节的融合。结果表明：大鼠硅肺模型制作成功。（3）治疗组肺组织内纤维细胞结节体积及数量均比硅肺模型组减少，巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润减少。用硅结节切面面积占整个视野面积的百分比半定量分析硅结节的大小，结果显示：治疗组的硅结节面积比硅肺模型降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 胶原VG染色结果 VG染色胶原呈鲜红色。（1）对照组胶原主要分布于肺泡间隔及血管壁，其他部位胶原少见。（2）硅肺模型组（图1A）可见胶原纤维呈条纹状分布于结节内部及其周围。（3）治疗组（图1B）胶原分布较硅肺模型组减少，胶原变细稀少。图像分析仪结果显示：硅肺模型组胶原含量比对照组增高，是对照组的5.29倍，治疗组的胶原含量比对照组降低，是对照组的45.58%，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.4 羟脯氨酸测定结果 羟脯氨酸测定结果显示：硅肺模型组胶原含量比相应对照组增高，是对照组的1.86倍。治疗组的胶原含量比硅肺模型组降低，是硅肺模型组的60.27%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.5 免疫组化检测NF-κB p65结果 NF-κB p65定位于胞核或胞质，可表达于肺间质细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，呈棕色颗粒。（1）对照组阳性细胞较少，主要表达于胞质，胞核未见明显表达，肺间质细胞少有表达。（2）硅肺模型组（图2A）阳性细胞较多，阳性颗粒的表达多位于胞核，阳性细胞主要分布硅结节内部及周围，肺间质细胞和巨噬细胞表达较多。（3）治疗组（图2B）阳性细胞数量比硅肺模型组减少，阳性颗粒的表达部分转向胞浆，肺间质细胞和巨噬细胞表达减弱。图像分析仪结果显示：硅肺模型组NF-κB p65阳性率比对照组升高，是对照组的2.36倍，治疗组的NF-κB P65阳性率比硅肺模型组降低，是硅肺模型组的64.55%，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 AcSDKP对硅肺大鼠硅结节面积及胶原含量表达的影响（±s，n＝10）

表1 AcSDKP对硅肺大鼠硅结节面积及胶原含量表达的影响（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与硅肺模型组比较。

组别 硅结节面积（HE染色）胶原的IOD（VG染色）羟脯氨酸含量（μg／mg）对照组 0 1 039±291 0.821±0.049硅肺模型组 41.19±8.09▽ 5 496±835▽ 1.528±0.116▽治疗组 25.18±5.66＃ 2 505±539＃ 0.921±0.100＃

表2 AcSDKP对硅肺大鼠NF-κB p65表达的影响（±s，n＝10）

表2 AcSDKP对硅肺大鼠NF-κB p65表达的影响（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与硅肺模型组比较。

组别 NF-κB阳性率（免疫组化法）NF-κB OD（免疫印迹法）9.00±4.69 1硅肺模型组 21.24±4.92▽ 2.97▽治疗组 13.71±3.92＃ 1.43对照组＃

图1 AcSDKP对硅肺纤维化大鼠肺内胶原纤维形成的影响 （VG染色×200）

图2 AcSDKP对硅肺纤维化大鼠肺内NF-κB p65表达的影响 （免疫组化×400）

2.6 免疫印迹法检测NF-κB p65表达结果 硅肺模型组NF-κB p65蛋白表达比对照组升高，是对照组的2.97倍，治疗组的NF-κB p65蛋白表达比硅肺模型组降低，是硅肺模型组的48.15%，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨 论

硅肺是由于长期吸入大量游离二氧化硅（SiO2）粉尘沉积于肺部引起的一种常见职业病，以硅结节的形成和广泛的肺纤维化为特征。硅结节形成的初始阶段是由吞噬硅尘的巨噬细胞聚集组成，继而成纤维细胞增生，结节内的胶原不断沉积，使之发生纤维化，形成纤维性硅结节，同时肺内还有不同程度的弥漫性间质纤维化［7］。

AcSDKP是一种生理性造血系统的生长抑制因子，对大鼠肾脏、心脏间质成纤维细胞及人肾小球系膜细胞的增殖与胶原的合成沉积有抑制作用［8］。AcSDKP能够减轻糖尿病小鼠肾小球硬化程度，改善小鼠肾脏功能［9］。在大鼠心肌梗死心衰模型中，AcSDKP能够减轻炎症，拮抗心脏间质纤维化［10］。在两肾一夹高血压大鼠和血管紧张素Ⅱ型高血压大鼠模型中，AcSDKP同样能减轻心、肾纤维化的程度［11-12］。

在本研究中，通过硅结节面积测定、大染色测胶原OD值及羟脯氨酸测定胶原含量，均发现治疗组肺组织硅结节面积及胶原含量比硅肺模型组减少，证明AcSDK能够抑制大鼠硅肺纤维化。

近年来，NF-κB与器官纤维化之间的关系日益受到人们的关注。NF-κB是一类能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质，是一种重要的核转录因子，在各种因子的相互影响和相互作用的复杂网络中作为转录调节核因子而起中心调控作用，参与免疫反应、细胞分化、生长调控、细胞内信号转导等［13］。通常NF-κB是2个亚单位p50和p65组成的异源二聚体，细胞处于未激活的静息状态时，p65亚单位与B抑制蛋白（I-κB）单体结合，覆盖p50蛋白的核定位信号，以失活状态存在于细胞质中。当机体受到外界因素刺激时，NF-κB被诱导活化，从胞质转向胞核，与DNA链上特异部位结合，诱导和增强其基因表达，导致促炎细胞因子、氧自由基、一氧化氮及前列腺素等炎性介质大量产生，引发炎症免疫反应，从而促进器官纤维化［14-15］。

在本研究中，通过免疫组化和免疫印迹法检测发现硅肺模型组NF-κB p65表达比对照组明显增高，并且对照组NF-κB p65阳性颗粒主要为胞浆表达，而硅肺模型组中阳性的部位多在胞核，以肺间质细胞和巨噬细胞阳性表达居多。这与Baroni等［16］在硅肺大鼠肺组织中观察到的NF-κB表达情况基本一致。反映了硅肺大鼠纤维化形成发展过程中NF-κB被激活，由胞质移向胞核，表达增强，促进细胞因子、黏附分子、趋化因子、炎症因子、氧化应激相关酶大量释放，他们可引起中性粒细胞及巨噬细胞的活化，增强中性粒细胞及单核细胞趋化功能，刺激成纤维细胞的增殖，导致肺纤维化。在本研究中，治疗组肺间质细胞和巨噬细胞的NF-κB p65表达比硅肺模型组降低，并且NF-κB p65的阳性颗粒的表达部分位于胞浆，提示在治疗组中，AcSDKP可能会通过增加I-κB的稳定性来抑制NF-κB p65的活性，进而影响着肺泡炎与硅肺纤维化的进展。

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