乳腺癌细胞中p73ɑ与ERɑ的相互关系

张佳娜，汪庆余，曾磊，陈青，陈婧，李庆，雷浪，王莉，郝华，苏晓燕，冯琼，刘繁荣，李里香，张文昌，徐高四，邬黎青

(1、南昌大学第二附属医院病理科，江西南昌330006;2、南昌大学第二附属医院分子医学中心，江西南昌330006；3、南昌大学护理学院，江西南昌330006;4、南昌大学第二附属医院肾内科，江西南昌330006)

·论著·

乳腺癌细胞中p73ɑ与ERɑ的相互关系

张佳娜1，2，汪庆余1，曾磊1，陈青1，2，陈婧3，李庆1，雷浪1，王莉1，2，郝华1，苏晓燕1，冯琼1，刘繁荣1，李里香1，张文昌1，徐高四4，邬黎青1，2

(1、南昌大学第二附属医院病理科，江西南昌330006;2、南昌大学第二附属医院分子医学中心，江西南昌330006；3、南昌大学护理学院，江西南昌330006;4、南昌大学第二附属医院肾内科，江西南昌330006)

目的探讨乳腺癌细胞中ERɑ蛋白与p73ɑ蛋白之间物理上及功能上的相互关系。方法采用蛋白印迹法检测ERɑ与p73ɑ的蛋白表达；用免疫共沉淀法检测ERɑ蛋白与p73ɑ蛋白之间的相互结合；用荧光素酶分析实验进一步检测ERɑ与p73ɑ基因的转录活性，以探讨ERɑ与p73ɑ蛋白表达改变的原因。结果(1)经蛋白酶抑制剂MG132处理细胞后，ERɑ蛋白及p73ɑ蛋白能结合成复合体。(2)共转染ERɑ与p73ɑ时，ERɑ及p73ɑ能相互抑制彼此蛋白表达。结论乳腺癌细胞中ERɑ及p73ɑ能结合形成复合体并能相互抑制彼此蛋白的表达。

乳腺癌；ERɑ；p73ɑ；相互结合

流行病学资料显示，乳腺癌在中国是最常见的恶性肿瘤之一，占所有肿瘤的7%～9%，而且其发病率在逐年增加[1]。大量文献提示雌激素刺激乳腺上皮细胞在乳腺癌的发生及发展中起主要作用。雌激素通过多种不同的机制引起细胞改变。其中主要机制是结合核蛋白雌激素受体(ER)[2]。本研究中，我们检测ERα是否会与p73α物理性地结合以及在蛋白水平表达上这两个基因是相互促进还是相互抑制。通过免疫共沉淀法发现ERα与p73α能结合形成复合体。并发现共转染ERα及p73α能检测出的ERα及p73α的蛋白量均明显减少。结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料MCF-7细胞株购买于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；P73α质粒及PCDNA3.0载体由Maki博士(美国芝加哥大学)惠赠；ERα质粒由Nardulli博士(美国伊利若依斯大学)惠赠；常规分子生物学试剂购于天根生化(北京)科技有限公司；多克隆的ERα抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，p73α单抗购自美国Abcom，β-actin单抗购自中杉金桥公司。

1.2 细胞培养及DNA转染MCF-7细胞株是含有野生型ERα乳腺癌细胞株，它还携带p73α基因，表达少量的p73α蛋白。MCF-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37oC培养。当MCF-7细胞长到60%的密度时，按照操作手册，利用转染剂Lipofectemin(invitrogen，Inc)把ERα及p73α同时转染到细胞中。通过增加空质粒，使每个转染中的DNA总量达到相等。为了减少蛋白酶对细胞内ERα及p73α的降解，蛋白酶抑制剂MG132(invitrogen，Inc)被用来处理细胞6h。

1.3 免疫共沉淀及免疫印迹常规培养MCF-7细胞，以2ml PBS洗细胞2次，刮入500μl的裂解液中并转入离心管中。细胞在冰上孵育30 min，之后

在4℃离心机中14000r/min离心15min以去除细胞残渣。免疫共沉淀时，260μg的转染过的细胞提取液中加入200ng的多克隆的ERα抗体沉淀细胞裂解液中的ERα抗原。ERα的免疫沉淀物被分离并结合在琼脂蛋白A珠子上。为了做免疫印迹，蛋白裂解液或ERα的免疫沉淀物在SDS-PAGE中分离并被转移到PVDF膜上进行免疫印迹。使用的抗体包括p73α单抗及β-actin单抗。

2 结果

2.1 ERα与p73α能结合形成复合体ERα及p73α都是可被蛋白酶降解的寿命很短的蛋白，内源性ERα及p73α蛋白很快被降解，并且ERα比p73α蛋白的寿命更短(maki30-32图1，列1及列3)。转染外源性ERα及p73α提高蛋白的表达量，经蛋白酶抑制剂MG132处理后，二者蛋白的降解减少，其浓度在细胞内明显增高(图1)。用抗ERα的多克隆抗体结合MCF-7细胞蛋白裂解液中的ERα抗原并用蛋白A琼脂珠子将抗原抗体复合物沉淀下来。脱开蛋白A琼脂珠子后，用SDS-PAGE将ERα分离出来并进行免疫印迹。结果表明ERa抗原与蛋白A琼脂珠子是充分结合的(图1，列2及列4)。我们进一步想知道想知道ERα与p73α之间是否有结合，故用抗p73α单克隆抗体标示ERα存在的PVDF膜。结果显示ERα与p73α形成了复合体，二者有结合(图1)。图1中列1、2及列3中的细小条带是内源性结合的结果。

图1 ERα与p73α能结合形成复合体

MCF-7细胞分成四组，1：PCDNA3.0 6μg，2：PCDNA3.04μg+Flag-ERα2μg，3：PCDNA3.0 2μg+Flag-P73α 4μg，4：Flag-ERα2μg+Flag-P73α 4μg的方案转染。转染后18h第四组加入MG132(20μM)作用6h，转染24h后进行细胞总蛋白提取，用抗ERα的多克隆抗体结合总蛋白中的ERα抗原并用蛋白A琼脂珠子将抗原抗体复合物沉淀下来。用沉淀下来的复合物进行SDS-PAGE电泳后用p73α的单克隆抗体进行免疫印迹分析。

2.2 ERα与p73α相互减少彼此的蛋白表达ERa与p73α能结合在一起形成复合体，但二者的功能相反，我们推测在蛋白表达上，二者是相互抑制的。为了检测这一假设，我们将MCF-7细胞分组转染ERα质粒或p73α质粒及共转染ERα质粒和p73α质粒，转染后提取总蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳后分别用ERα于p73α抗体标记蛋白。结果表明共转染ERα及p73α时，二者的蛋白检出量明显减少(图2)。

图2 ERa与p73a相互抑制蛋白表达

将MCF-7细胞分成四组，按照1：PCDNA3.0 6μg，2：PCDNA3.04μg+Flag-ERα2μg，3：PCDNA3.0 2μg+Flag-P73α 4μg，4：Flag-ERα 2μg+Flag-P73α 4μg的方案转染，转染24h后进行细胞总蛋白提取，总蛋白SDS-PAGE电泳后用ERα和p73α的多克隆抗体进行蛋白印迹分析。

3 讨论

雌激素受体(ER)是核受体家族成员，能调节雌激素的多种功能。ER有多种异形体。其中ERɑ由6个进化稳定的功能区组成，最高度保真的是DNA结合功能区(DBD)。ERɑ与雌激素应答基因上的雌激素应答成分(ERE)的结合必须有DBD的存在。ERɑ另一高保真功能区是配体结合区(LBD)，它能引导ERɑ与激素之间的结合。一旦结合激素，ERa发生构象变化，其DBD结合到雌激素应答基因上的雌激素应答成分(EREs)。ERɑ是雌激素激活的转录因子，EREs位于雌激素应答靶基因的启动子区域，通过直接结合到EREs或间接通过像AP1及Sp1这样的DNA结合因子结合到EREs上，ERa被征集到靶基因的启动子区，调控靶基因mRNA的转录而改变靶细胞中多种雌激素应答基因的表达，从而调节各种组织的生长及发育，促进乳腺癌细胞的增生[3-5]。乳腺的癌前病变及癌肿中ERɑ的表达均增高[6]，在雌激素的作用下，这些病变中的细胞增生更快。

p73是p53家族成员。野生型p53是转录因

子，它能结合在多种靶基因的启动子区域从而激活这些靶基因的转录。p53通过激活其信号传导通路的某些下游靶基因，如Waf1/p21,引起细胞周期阻滞而抑制细胞生长[7]；通过激活Fas/Apo1,Noxa, Bax,PUMA及Apaf1基因等，引起细胞凋亡而抑制肿瘤的生长[8,9]。癌肿引起的p53突变阻断了p53序列特征性的DNA结合能力，导致这些生长抑制靶基因的表达降低。多数癌肿中，由于p53基因突变或p53调节因子的改变p53肿瘤抑制通路而失去抑制肿瘤的活性[10-12]。丧失功能的p53突变发生在50%以上甚至所有的人类癌肿中，p53缺如的小鼠发生多种肿瘤并在幼小时就死去[13,14]。乳腺癌中，p53的体突变率是21.37%，还存在一定比率的种系突变(www-p53.iarc.fr)。P73是p53相关蛋白，与p53共享高百分率的相同氨基酸序列，有多个同源异形体。其中P73α和p53能执行某些相同功能。如：当过度表达时，p73α能结合并激活多种p53靶基因而引起细胞生长阻滞或凋亡[15,16]。而且象p53一样，当细胞应对某些压力时，内源性p73α增高。故在p53缺如的细胞中，p73α能引起细胞生长阻滞及调亡。肿瘤细胞很少发生p73α突变，Shishikura及Schwartz等在乳腺癌中未发现p73的突变[17,18]。在p53异常的乳腺癌中p73α的抑制癌肿的作用十分重要。ERα促进肿瘤生长，p73α抑制肿瘤生长，两者功能相反。我们推测二者之间可能存在负向调节。ERα能结合p53并能抑制p53的功能已有报道[19]，但乳腺癌细胞中ERα与p73α的相互关系如何至今尚未有研究发表。

ERα能结合p53并抑制p53的功能已在体外转染的细胞中证实。Liu等的实验表明ERα的含LBD及AF-2(activation function-2)功能区的AA285~AA395段参与p53的结合，而非ERα的DBD；而且表明ERα结合在p53的C末端的AA319~AA393。p73和p53的氨基酸序列相似，二者均含有N端的转录激活区(TAD)，脯氨酸富有区(PRD)，中央的DNA结合区(DBD)以及C端的寡聚化区(OD)，其中DBD的氨基酸相同率高达63% (21,22)。从基因的OD段开始，p53的C末端有86AA。p73α的C末端有285AA，有含p53的C末端的AA319~AA393序列的可能。我们的结果表明ERα与p73α有明显的结合。除外源性结合外(图1列4)，我们还检测到了二者内源性的结合(图1列1及列3)。列2中见大量的ERα被沉淀下来，我们推测有相应量结合其上的p73α蛋白应被检测到，但结果图中几乎见不到p73α。可能的原因是转染的p73α质粒不足，p73α蛋白被ERα降解，或ERα抑制了p73α的转录活性等(图2)。可见，乳腺癌细胞中ERɑ及p73ɑ能结合形成复合体并能相互抑制彼此蛋白的表达。

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Co-relation between ERɑ and p73ɑ in breast cancer cells

Z HANG Jiana，WANG Qingyu，ZENG Lei，et al.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo investigate the physical and functional relation between ERɑ and p73ɑ in breast cancer cells. Methods Protein expressions of ERɑ and p73ɑ were examined by Western Blot.The binding assay for ERɑ and p73ɑ was tested with Co-IP and immunoblot.Transcriptional activity of ERɑ and p73ɑ was analysed by Luciferase assay.Results and Conclusion (1)ERɑ and p73ɑ can bind to each other.(2)ERɑ and p73ɑ can be combined to form complex and mutually inhibit protein expression of each other in breast cancer cells.

Breast cancer；ERɑ；p73ɑ；Binding

R739.7

A

1674-1129(2013)01-0004-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.002

国家自然科学基金资助项目（项目编号：30960430）；江西省自然科学基金资助项目（项目编号：20114BAB205053）

张佳娜，女，1987年11月生，南昌大学医学院病理学与病理生理学硕士研究生，研究方向为肿瘤分子生物学。

邬黎青，病理学博士，病理科主任，研究生导师。