利用生物制剂破解秸秆抗营养因子的研究进展

■张立霞 刁其玉 李艳玲 屠 焰

（中国农业科学院饲料研究所，北京 100081）

农作物秸秆是仅次于煤、油、气的第四大能源，是一种非常重要的可再生生物质资源。我国是一个农业大国，有着极其丰富的农作物秸秆资源，每年全世界秸秆产量有30亿吨之多。2009年我国农作物收获后剩余的秸秆产量高达7.4亿吨，位居世界前列[1]。但是由于农作物秸秆理化性质的特殊性，其作为饲料有很多的限制性。秸秆质地比较粗硬、适口性不好、营养价值较差、消化利用率比较低等，只有很少一部分能被用来饲养草食动物。单胃动物一般不能利用秸秆，反刍动物对秸秆的消化率也只是仅有20%～30%[2]。如何提高秸秆资源的利用是一项长期被关注的事情。近年来，国内外对如何有效提高秸秆利用率进行了大量的研究，常用的方法主要有物理法、化学法、物理化学法和生物法。其中物理处理包括粉碎、软化、爆破、颗粒化技术等，化学处理包括氨化、氧化、酸碱化处理等，物理处理只是改变了秸秆的物理性状，并没有改变秸秆本身的化学结构，

不能解决秸秆消化率低和可利用营养物质少的根本问题；化学处理生产成本较高，经处理后化学离子流失到环境中，对环境污染严重[3]，而生物法主要是酶处理和益生菌处理，这种处理既不需太复杂的设备和过多的能量等消耗，也不需要高温、高压、强碱和强酸等条件，只依靠益生菌和酶制剂的生物降解能力来降解秸秆中的抗营养因子，具有能耗低，污染小，易于操作等优点[4]。研究结果表明，微生物及其代谢产物具有破解秸秆纤维结构的功能，故利用生物技术提高秸秆利用率得到广泛关注。

1 农作物秸秆主要化学成分

1.1 三种主要农作物秸秆的化学成分

表1 三种主要农作物秸秆中主要成分含量(%)

农作物秸秆是收获作物主产品之后所有大田剩余的副产物及主产品初加工过程产生的副产物，包括一些禾本科作物和豆科作物的秸秆，如小麦秸、玉米秸、大豆秸等[6-7]。秸秆中几乎能够被完全消化的是细胞内容物，细胞壁因含有较多的粗纤维，导致在动物体内消化缓慢且不完全。细胞壁的主要成分是粗纤维，粗纤维中的纤维素被木质素和半纤维素包裹着，木质素有着坚硬的外壳，木质素与纤维素、半纤维素等之间也有酚酸相连接，微生物和酶制剂均不易接触到纤维素，因此纤维素的分解受到限制[8]。为了提高秸秆的利用，就需要采用适当的方法对原料进行处理，达到降解木质素，提高秸秆利用率的目的。

1.2 农作物秸秆的结构组成

农作物秸秆由细胞壁和细胞内容物组成，其中细胞壁所占的比例一般都在80%以上[9]。细胞壁主要由纤维素、半纤维素、蛋白质和木质素组成。这些聚合体与少量的如乙酞基和酚酸化合物，一同构成了复杂的三维立体结构。其他成分如角质、单宁、蜡质和矿物质等，也是细胞壁的组成成分。细胞内容物主要是一些可溶性的碳水化合物、部分蛋白质等。

细胞壁是围绕在植物原生质体外的一种复杂的网状结构，是具有一定弹性和硬度、参与维持细胞的形态、增强细胞机械强度的重要结构[10]。作物秸秆的细胞壁是植物细胞的重要组成部分，在秸秆细胞中所占比例也最大，其中含有的结构性多糖类是反刍动物所能利用的重要营养物质[11]。

在秸秆细胞壁中，主要成分是纤维素。它是由葡萄糖单位之间以糖苷键连接而成的无分支聚合体，以反式连接相连，从而形成扁带状的微纤维状。在自然界中纤维素即以这种微纤维组成的结晶状态存在。微纤维之间又有氢键连接，可以与半纤维素相连。一般情况下，纤维素化学性能稳定，但在高温高压和酸性的条件下，可以水解为葡萄糖[12]。在反刍动物体内，其胃肠道中共生的微生物能够分泌纤维素酶等，将纤维素降解成乙酸、丙酸、丁酸等，因而能被反刍动物利用。

半纤维素在细胞壁中含量仅次于纤维素，在细胞壁中通过氢键与纤维素以及通过共价键与木质素相连接。半纤维素主要包括聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类三大类[13]。禾本科植物中半纤维素的主要成分是聚木聚糖类，它通过β-1，4木糖残基连接而成的木聚糖骨架和支链形成。木聚糖单元在C2或C3位置可被乙酸、阿拉伯糖等取代，进而形成支链。半纤维素覆盖在纤维素微纤丝之外并通过氢键将微纤丝交联成复杂的网格，形成细胞壁内高层次上的结构。纤维素、半纤维素和木质素三者紧密结合，构成植物细胞的主要成分[14]。

木质素的基本结构单元是苯丙烷，通过醚键和碳碳键连接形成复杂的无定形高聚物。典型木质素是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇这3种不同的醇作为先体物质组成基本结构。它能与半纤维素分子紧密交联形成疏水的网状结构，整个细胞壁就成为一个紧密的网状，增加了细胞壁的机械强度和对病原体的抵抗能力。与此同时，也阻碍了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素接触，从而降低纤维多糖的降解效率。因此木质素被认为是抑制秸秆利用率提高的主要限制性因素。玉米秸秆中木质素含量可达到19%～23%，直接影响玉米秸秆的利用效率[15-17]。

我院70例高血压患者进行此次研究(2015年12月7日至2018年3月5日),以随机基本原则为依据,均分为两组。

2 秸秆中的主要抗营养因子

理论上来讲秸秆细胞壁可以完全被反刍动物瘤胃微生物所降解，但是只有20%～30%才能被降解。反刍动物瘤胃是一个特殊的结构，其内部含有能分泌纤维素酶、半纤维素酶等的微生物，可以降解纤维素和半纤维素，但是没有直接降解木质素的微生物，因此，木质素成为影响农作物秸秆降解的限制性因素[18]。除此，酚酸是植物的次级代谢产物，在细胞壁中通过酯键或醚键与多糖和木质素形成多种交联。目前研究较多的酚酸主要是阿魏酸和香豆酸。现在认为阿魏酸、二聚阿魏酸、香豆酸及香豆酸与阿魏酸的比值也有可能是影响秸秆细胞壁的降解抗营养因子[19]。

2.1 木质素

木质素不属于营养物质，是植物细胞壁中最难降解的部分，但是却直接影响饲料纤维物质的降解率。木质素对秸秆饲料降解有两大抑制作用：一是木质素与纤维素、半纤维素等的特殊交联结构限制了微生物和酶与多糖的接触，抑制了纤维素等的消化；二是木质素本身难以被降解，充盈在瘤胃内，限制了动物对干物质的采食[20]。

2.2 阿魏酸

阿魏酸在植物不同生长阶段和不同组织部位含量不同。阿魏酸主要有两个功能团，羧酸基团和酚酸羟基，阿魏酸通过酯键与多糖和醚键与木质素相连，并且在木质素和多糖间或多糖之间形成酯醚桥[21]，这些酯醚桥改变了秸秆细胞壁的机械强度和延展性，并且降低了植物细胞壁多糖的降解效率。在植物细胞壁的形成过程中，阿魏酸逐渐沉积并且与多糖、木质素等交联，形成具有复杂酯醚交联键的阿魏酸聚合物[22]。其实植物细胞壁的木质化程度的提高即是以酯化的阿魏酸多聚糖作为起始位点和成核位点。因此，阿魏酸的存在能够增加木质素对植物消化率的抑制作用。阿魏酸也就成为影响秸秆消化率的重要因子。

2.3 阿魏酸二聚体

二聚阿魏酸被比作植物钢制网架的焊接点。在相邻多糖主链上的两个阿魏酸分子间会形成化学键，而所形成的化学键是植物细胞壁网状结构的重要部分。它能够限制细胞壁的延伸，加固植物细胞壁，防止细胞壁被瘤胃微生物降解，因此降低了细胞壁的消化率。

2.4 香豆酸

香豆酸通过酯键和醚键与木质素相连，只有少量的通过酯键与多糖相连（Sun等，2002）。大部分香豆酸会在植物次级细胞壁的形成过程中被吸收并进入植物细胞壁，逐渐沉积并形成木质素[23]。因此，香豆酸被认为是反映植物细胞壁木质化程度的指标。

2.5 香豆酸和阿魏酸的比值

有的研究认为这个比值与植物细胞壁消化率呈负相关[24]。但是有些研究认为这个比值往往极少考虑阿魏酸对植物降解的抑制作用。目前，香豆酸和阿魏酸的比值与植物细胞壁降解率之间的关系仍然存在很大争议。

3 降解农作物秸秆的微生物及其分泌的酶类

3.1 微生物

3.1.1 细菌和放线菌

反刍动物瘤胃微生物中细菌的种类最多，数量也最大。它们的功能也各不相同，主要有纤维素分解菌、半纤维素分解菌、淀粉降解菌、蛋白降解菌等，它们将动物摄入的饲料转化为可以吸收的营养物质。细菌一般比表面积比较大，营养物质能够快速的进入细胞。因此，在瘤胃内细菌往往多于真菌，产孢子的芽孢杆菌等还可以抵御恶劣的环境[25]。研究表明，一些细菌具有分解纤维素的能力[26]。三种主要分解纤维素的细菌是革兰氏阳性菌琥珀酸丝状杆菌和革兰氏阴性菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌。溶纤维丁酸弧菌具有木聚糖酶活性，可以降解木聚糖。普雷沃氏菌并不是高度降解纤维素的细菌，但是却可以产生一系列的木聚糖酶。除此，部分细菌还可以降解半纤维素和木质素[27]。

此外，放线菌也有降解木质纤维素的能力，但是放线菌繁殖慢且对纤维素和木质素等的降解率低。一般来说，放线菌比较容易利用半纤维素，对纤维素的利用较少，且能不同程度地改变木质素的分子结构。此外，放线菌能够抵制恶劣的环境条件，耐高温、酸碱，故在高温条件下放线菌优于真菌。放线菌在自然界中分布广泛[28]。

因此，学者对放线菌的研究逐渐增多。Fennington等[29]采用化学和紫外照射等方法对Termomonospora curvata进行混合诱变，筛选抗葡萄糖阻遏突变株。Wood等[30]研究了cAMP对Thermomonospora curata菌株纤维素酶生物合成过程中的作用。George等[31]从堆肥中分离筛选得到一株产纤维素酶嗜热热单胞菌属放线菌。徐杰等[32]从土壤中分离得到一株具有降解纤维木质素结构的酶的菌株，经鉴定为灰略红链霉素。宋波等(2005)[33]分离筛选得到耐碱的链霉菌。吴翔等(2007年)[34]在堆肥样品中筛选出了一株产纤维素酶的高温放线菌。

3.1.2 真菌

真菌分布广泛，大多数在5～37℃下生长良好。在高温环境下的真菌对纤维素、半纤维素和木质素有很强的分解作用，它们通过分泌胞外酶和菌丝穿插作用共同降解纤维素和木质素。在堆肥过程中会有高温真菌不断地发生作用降解木质纤维素。木霉、曲霉、青霉、轮枝孢霉、根霉等，能分解纤维素和半纤维素，并在有氧中温下作用最强，绿色木霉能产生高活性的纤维素酶。洋蘑、鬼伞菌、茯苓、多孔菌、韧皮菌等白腐真菌能够降解木质素，白腐真菌中黄孢原毛平革菌研究最多。Denis等指出瘤胃厌氧真菌对纤维降解非常重要，其中研究的最好的是Neocallimastix sp[35]。潘亚杰等[36]指出白腐真菌是降解木质素能力最强的微生物。

3.2 分解酶类

降解农作物秸秆的酶类主要是纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和木聚糖酶等。

纤维素酶目前分为3种类型，由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素酶广泛存在。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属、曲霉和青霉属。半纤维素酶主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶，是分解半纤维素的酶的总称。在饲料工业中应用较多的是β-葡聚糖酶。

木质素的降解酶系非常复杂，目前认为最重要的木质素降解酶有3种：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。除此之外，还有芳醇氧化酶、乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶、酚氧化酶、过氧化氢酶等。木质素的降解主要是真菌起作用。目前，研究较多的白腐菌有：黄孢原毛平革菌、烟管菌、变色栓菌、糙皮侧耳等[37]。

4 提高农作物秸秆利用率的生物学处理方法

4.1 青贮发酵

青贮发酵即自然发酵法，其原理是在厌氧条件下，植物体上的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，发酵产生乳酸，迅速降低pH值，从而杀灭或者抑制各种微生物的活动，达到长期保存青绿饲料的目的，同时可以提高饲料的适口性、消化率和营养价值。青贮是保存青绿饲料的一种简单、可靠且经济的方法。而在农作物秸秆中，只有玉米秸适合青贮。在生产中，青贮已广泛应用，而且现在青贮添加剂广泛应用，主要有营养型添加剂、纤维素酶类添加剂、微生物制剂和抑制不良发酵的添加剂[38]。

青贮添加的微生物制剂主要是乳酸菌，一般作物秸秆含乳酸菌少，添加后可以加快发酵速度，抑制其他有害微生物，而且可以产生轻微的酸香味或水果味，增加适口性，提高消化率。常用的乳酸菌是同型发酵乳酸菌，例如植物乳酸杆菌、粪链球菌和片球菌，它们能迅速降低发酵底物的pH值，提高乳乙酸的生成比例，有效降低乙醇和氨态氮的产量。目前关于异型发酵乳酸菌的作用效果研究较少，且仍存在很多争议。洪梅等[39]对分离自中国青贮窖中的一株发酵乳杆菌BLF01进行研究，发现发酵乳杆菌BLF01属于异型发酵，且可以作为一种青贮添加剂使用。除此，对青贮饲料饲喂效果的研究也很多，马建齐等[40]用经过青贮、黄贮处理的玉米秸秆饲喂肉牛，实验表明，青贮秸秆的饲喂效果明显优于黄贮料。秸秆黄贮料组每头均日增重876.3 g，秸秆青贮料每头均日增重1 128.36 g,秸秆青贮料组头均日增重比黄贮料组提高128.76%,且组间差异显著。

4.2 酶制剂处理

通常把具有酶特性的高效生物活性物质与少量的载体混合制成酶制剂。酶制剂中一般含有纤维素分解酶、半纤维素分解酶、果胶酶，甚至还含有淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等。这些酶能降解饲料中的纤维素、半纤维素，从而提高饲料的利用率，改善饲料的品质[41]。

目前，国内有关酶制剂在秸秆类饲料青贮和黄贮中的应用研究报道很多。Alvarez等(2009)[42]报道在奶山羊日粮中添加纤维素酶可以提高日粮干物质和粗蛋白质的消化率以及酸性洗涤纤维(ADF)、燕麦秆中性洗涤纤维(NDF)和ADF的瘤胃降解率。

4.3 复合菌处理

微生物处理主要是通过添加能够降解木质纤维素的微生物对秸秆进行发酵，提高其适口性和消化率。对单一微生物处理秸秆的研究较少，复合微生物处理秸秆的研究效果显著。张洋等（2010）[43]以秸秆为主要材料，采用生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母对秸秆进行发酵，经发酵后，粗蛋白增加率和粗纤维降解率分别达到260.0%和28.89%。据徐坚平等[44]研究表明绿色木霉和饲料酵母共生发酵秸秆，单细胞蛋白达30%，纤维素转化率达51%。在使用微生物处理秸秆时，需要注意验证菌种间是否存在拮抗。史国翠[45]等利用康氏木霉与酵母混合发酵处理稻草秸秆，证明两菌种间不仅无拮抗，而且酵母菌能促进康氏木霉的生长。

现在的研究表明，酶制剂与微生物制剂配合使用可以发挥更大的效果。金加明[46]指出，用绿色木霉产生的纤维素粗酶液和酵母菌混合处理的玉米秸秆饲喂小尾寒羊，试验组日增重比对照组高49.1 g。但是由于不同的酶和菌种的专一性，在它们联用时，还应考虑拮抗作用。王建兵等[47]联用复合产乳酸菌、纤维素酶，结果表明效果优于单纯添加时，而且二者之间未产生拮抗作用。陈合等[48]利用黄孢原毛平革菌、外源纤维素酶、木聚糖酶处理玉米秸秆，最终使木质素、纤维素、半纤维素的降解率分别达到67.0%、60.4%、33.0%，秸秆还原糖的含量达到0.507 g。这些都表明菌酶共降解为玉米秸秆的生物利用提供了一种新方法。

5 结语

我国是一个农业大国，每年产生大量的农作物秸秆，而秸秆是一种很重要的可再生资源，所以，提高秸秆的利用效率将能使秸秆饲料具有巨大的利用潜力。现今国内外主要致力于农作物秸秆的生物技术处理，但是生物发酵技术现在仍然存在一定的问题，所用的生物技术如酶解法与微生物发酵法等仍处于初级阶段。目前，玉米秸秆生物发酵技术有较大发展，但是仍未找到玉米秸秆有效降解的途径。

木质素是秸秆饲料降解的限制性因素，木质素与纤维素、半纤维素等的交联影响了秸秆的降解效率，因此，寻找提高打开交联键的有效方法十分重要。现今利用生物技术处理秸秆的应用比较广泛，但是秸秆降解率提高的原理仍有待于进一步探讨。