内皮祖细胞与肝脏损伤修复

潘 可 综述 李崇辉，张爱群，董家鸿 审校

解放军总医院 全军肝胆外科研究所，北京 100853

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，亦称血管细胞(angioblast)，作为一种前体细胞能够直接分化为血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)。目前认为，骨髓是内皮祖细胞的主要来源，除此之外在血管内膜、脾脏、心肌、脂肪和肝脏等多种组织器官中也发现其存在。1997年，Asahara等[1]首次从循环外周血中分离出能够直接分化为血管内皮的前体细胞，并为之命名为血管内皮祖细胞。近年的研究结果表明，EPCs在外周血管疾病、心脑血管疾病、肾脏疾病、肿瘤血管的形成以及创伤愈合等方面均发挥显著作用[2-5]。目前与肝脏疾病相关的EPCs研究仍处于起步阶段。本文对内皮祖细胞的生物学特性、功能及其参与肝脏损伤修复的研究进展概述如下。

1 EPCs概念

EPCs是一种来源于骨髓以及循环系统的单个核细胞，具有自我更新以及增殖并最终分化为血管内皮细胞的能力，暂无成熟的血管内皮细胞表型标记的表达；出现生理或病理等因素的刺激时能被动员至缺氧、缺血组织并分化为内皮细胞，促进血管的再生[6-7]。EPCs能够分泌多种促进血管新生的细胞因子，其中包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)以及白介素-8(IL-8)等[8]。未分化的EPCs呈圆形，已分化的EPCs呈梭形或纺锤形，仅仅从形态学水平很难与其他细胞加以区别，目前对于EPCs所采取的鉴定方法主要是依靠其细胞表型标记来进行，但迄今并无公认的明确统一的鉴定标准。表型特征为CD34+/CD133+/VEGF-R2+的细胞通常即可认为是EPCs。近年来的研究又发现，起源于脐血单核细胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的细胞也可分化为血管内皮细胞[9]。

EPCs的确切生物学特性仍有待进一步验证，对于它们是否可以作为一种在结构与功能上同质的细胞群体的讨论目前仍存在争议。已知骨髓是EPCs的主要而非唯一来源，目前已经在外周血、心肌及脂肪等多种不同的组织中分离出内皮细胞样的干/祖细胞[10]。EPCs的来源有很多，包括Sca+骨髓成血管细胞、外周血来源CD34+/VEGF-R2+的单核细胞、CD34-侧群细胞以及组织固有的前体细胞。最新观点认为，内皮祖细胞是起源于造血干细胞或者成血管细胞亚群以及间充质干细胞的一类异质细胞的集合。通常说来，骨髓来源的EPCs同时表达三种标志物—CD34、VEGFR2(Flk-1)与CD133；而血液来源的EPCs则表达HSC、c-kit与Sca-1，随着进一步分化失去早期标志物CD133进而开始表达VE-cadherin与von Willebrand factor(血管假性血友病因子)。

2 EPCs的功能与应用

循环系统中的EPCs在正常生理条件下含量并不多。缺血、局部血管损伤、烧伤、创伤以及细胞因子等各种刺激因素均能诱导骨髓中的EPCs动员进入外周血液循环系统，在相关因子的趋化作用下向缺血、缺氧组织或受损部位迁移，归巢定植于内皮损伤处并最终增殖分化为成熟内皮细胞。归巢的EPCs还具有促进相邻内皮细胞增殖分化的能力。此外，EPCs不仅能够促进血管生成，修复内皮损伤，还具有分泌多种促血管新生的生长因子的作用。

骨髓移植小鼠心肌梗死模型的组织学结果显示，供体来源的内皮细胞定位于梗死缘带的血管新生区域。Adams等[11]发现，运动诱导冠心病患者心肌缺血时，循环系统内EPCs水平升高。缺血可有效动员EPCs迁移，这一结论目前已经在缺血性休克、心肌缺血以及肾缺血患者和实验动物模型中得到证实。多种不同的细胞因子和趋化因子均参与EPCs的归巢。Murayama等[12]证实在缺血部位移植含有VEGF的填充物，可引起移植部位骨髓来源EPCs的聚集，提高血管新生能力。在不同疾病或者同一疾病的不同阶段，EPCs的数量与状态会出现不同程度的变化。可通过检测EPCs从而间接评估相关疾病的严重程度和进展阶段，如心血管疾病的发生风险、糖尿病并发外周血管病的发病率以及抗癌药物的疗效等。目前已有少量临床数据初步证实了自体EPCs细胞移植在急性心肌梗死方面的有效性[13]。

3 EPCs与肝脏损伤修复

3.1 EPCs用于肝纤维化治疗研究 慢性肝脏损伤最终均可发展为肝纤维化、肝硬化乃至肝衰竭。肝损伤的防治已成为全球探讨的严峻课题。目前治疗肝损伤的策略主要包括以下几个方面：促进肝细胞的再生，纤维化发生的防治，已有纤维化水平的逆转以及促进正常肝结构的形成。尽管目前已存在很多治疗肝损伤的方法，但至今仍无理想的临床治疗手段。现有的药物性治疗多数存在疗效有限、作用靶点单一和体内毒性聚积等弊端。细胞移植可作为一种损伤较小、并发症相对较少的潜在有效途径。参考目前EPCs在心血管与肾脏疾病领域初步的研究成果，试图探索一条新的行之有效的肝脏损伤修复途径。

骨髓来源的EPCs移植目前已被用于肝纤维化治疗的研究。Taniguchi等[14]研究发现，在四氯化碳诱导的肝脏功能损伤小鼠体内注射的EPCs可在肝细胞凋亡的病灶处大量聚集，形成血管状结构，明显提高肝纤维化小鼠的存活率。Nakamura等[15]的研究结果显示，移植单一或重复骨髓来源的EPCs后，可抑制肝星状细胞的活化，增强基质金属蛋白酶活性，调节肝细胞增殖，从而缓解大鼠肝纤维化程度。Liu等[16]在大鼠肝纤维化模型中证实，骨髓源EPCs移植可降低α-SMA、collagenⅢ与TGF-β的表达量，而四氯化碳处理所导致的albumin和Ki67的水平降低则恢复至正常。现有的研究结果表明，VEGF分别通过与EPCs表面的两种受体VEGF-R1、VEGF-R2的相互作用，促进EPCs的增殖，调节黏附分子的表达，进而实现对EPCs的动员；同时也可通过诱导造血因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)的释放发挥动员作用。PDGF则可通过作用于VEGF-R1实现EPCs的动员，促进坏死部位的血管新生。此外，还有很多不同种类的生长因子，包括血管生成素-1(angiogenin-1)、成纤维细胞生长因子(fibmblast growth factor，FGF)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)等也参与促进EPCs动员的过程。

EPCs移植可诱导生成促进肝再生、促进细胞外基质的降解或抑制细胞外基质生成的各种生长因子，促进肝细胞增殖，减缓肝纤维化进程，从而为肝脏疾病的治疗提供一种前景光明的新手段。

3.2 EPCs与肝脏缺血性损伤 肝脏组织缺血损伤后，恢复血液灌流时会导致组织损伤进一步加剧。肝脏外科和肝脏移植过程均不可避免此种损伤。截至目前，肝脏移植物功能丧失和小肝综合征始终是移植医生所面临的两大难题，其发生和发展与肝脏缺血性损伤的关系极为密切。EPCs移植有望成为改善肝脏缺血性损伤的潜在手段。目前对外源性或自体扩增EPCs移植的研究主要集中于缺血组织血管新生、心血管疾病、肾脏疾病以及组织工程等几个方面。在不同缺血动物模型中静脉注射EPCs后，它们均可归巢于缺血组织并促进新生血管的生成，但是注射成熟的内皮细胞后却未见相似效应。Kawamoto等[17]将健康人血液来源的EPCs经静脉途径注射至裸鼠急性心肌梗死模型，4周后观察发现毛细血管密度增加，心脏功能得以改善。Hess等[18]将绿色荧光蛋白(GFP)标记的骨髓源EPCs移植入结扎大脑中动脉(MCA)的大鼠卒中模型，发现EPCs在缺血部位的血管区域聚集，表明骨髓源EPCs参与了脑缺血内皮细胞的再生，促进血管新生的发生。EPCs还能显著改善肢体的缺血状况，Kalka等[19]在后肢缺血的裸鼠动物模型中局部注射体外扩增的人源EPCs后发现，缺血区域毛细血管密度增加，组织血供明显改善，缺血肢体的成活率显著提高。此外，在组织工程化微血管中接种EPCs后可以改善其生物学特性，使之更接近于正常生理状态，减少凝血以及栓塞的发生率[20]。具体作用机制可能是通过EPCs移植恢复血管的级联生成，从而促进血管的新生、成熟与稳定。

EPCs除可直接分化为血管内皮细胞外，还能通过自分泌/旁分泌的途径参与血管内皮的受损修复，而其修复功效比单纯给予任一种血管生成因子都更为显著。EPCs在新生血管生成中的重要作用已在中风、皮肤损伤、肢体及心肌缺血等多种动物模型的研究中得到验证，但是对于肝脏缺血再灌注损伤的治疗研究还未见报道。然而我们可预期在多种肝脏疾病模型、肝脏移植过程中，骨髓来源的EPCs能够通过其病变部位的趋化性及分泌血管生成因子等特性参与血管内皮的修复，改善肝组织损伤。

3.3 结合基因修饰的EPCs移植治疗 将内皮祖细胞作为基因治疗的载体进行创伤修复的研究正在进行中，目前常用的基因包括VEGF基因、SDF-1基因、内皮一氧化氮合成酶(eNOS)基因、端粒酶逆转录酶(TERT)基因、人低氧诱导因子1-α(HIF1-α)基因，成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因等等。其中体外过表达的VEGF基因可增强EPCs的新生血管特性，提高创伤后修复功能，促进缺血动物模型新生血管的形成，而eNOS基因则是通过动员EPCs修复血管内皮的损伤，抑制损伤后新生内膜的过度增殖[21]。通过基因修饰改变细胞表型是用于改善EPCs生物学性状的有效手段，提高对患者机体内各种不利因素的耐受能力，改善其治疗效果。与单纯移植EPCs到野百合碱诱发的肺动脉高压大鼠相比，表达肾上腺髓质素的EPCs移植明显具有更好的改善作用[22]。利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)可提高细胞增殖能力、延长细胞寿命等特性，EPCs转染hTERT后，可增强其内膜修复与血管新生的作用，显著挽救肢体损伤[23]。用表达VEGF-164基因的腺病毒载体转染EPCs后发现，细胞的增殖、黏附等能力增强，不仅有效促进血管新生与血流恢复，同时显著降低了肢体坏死与离断程度[24]。转染FGF1基因后，EPCs原有的迁移活性、成血管能力与存活力均得到明显增强，从而能够更好地改善猪慢性心肌缺血模型中缺血区域的血液灌流情况[25]。与此同时，采用基因治疗的方法也可在一定程度上避免使用药物动员EPCs时的全身不良反应。

EPCs在肿瘤的血管系统生成方面的作用目前仍存在争议。现有的动物实验已表明，在EPCs中导入编码血管新生抑制因子的基因从而促使血管生成抑制剂在体内持续表达，可以明显抑制肿瘤的生长。提示可将EPCs作为一种潜在的行之有效的细胞载体，用于转运抑癌基因、抗血管生成因子、抗肿瘤药物等，靶向于肿瘤病灶以抑制肿瘤生长，从而为肿瘤治疗提供新一代的靶向工具，不失为未来肿瘤治疗的发展方向[26]。

4 前景与展望

正常生理状态下EPCs少量而不可或缺的存在于循环系统之中，一旦发生机体缺血、组织损伤和细胞因子刺激等情况，EPCs可从骨髓向靶部位动员、分化及增殖，形成新生血管，参与内膜修复。EPCs的这种特性在未来肝损伤修复的研究与治疗领域具有重要的意义与广泛的应用前景。但目前仍然存在很多亟待解决的问题，例如表面标记物的确定与筛选，体外的有效分离纯化，体内的安全有效扩增，以及避免与治疗相关的各种不良反应等。作为近年研究的热点，EPCs作为肝损伤修复的新手段，有望在不久的将来用于临床治疗肝损伤。

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