阿尔茨海默病相关生物标志物的研究现状及进展

李锡海，于明，吴金美*

(1.江苏科技大学生物技术学院，江苏 镇江212003;2.江苏大学附属医院神经内科，江苏 镇江212001)

阿尔茨海默病(Alzheimer＇sdisease，AD)是一种中枢神经系统常见的、进行性神经退行性疾病，主要病理特征为脑神经细胞外老年斑(senile plaques，SP)和脑神经细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD 的发病机制非常复杂，迄今尚未完全明确。普遍认为AD 为多因素影响的综合征，患者的年龄和家族史为最大致病危险因素。

AD 经由症状前AD、轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，MCI)逐步发展成。AD 患者的分子病理学改变先于认知功能损害数年甚至数十年，因此，在人体中及早发现典型的AD 样病理物质是早期诊断AD 的关键。临床上诊断AD 主要借助病史、神经心理鉴定以及排除其他痴呆类型等，但上述方法的特异性和灵敏度都不高。所以，寻找灵敏度高和特异性强的AD 生物学标志物并应用于临床诊断就显得尤为重要。

1 与AD 相关的主要生物标志物

1.1 淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)与β-淀粉样蛋白(amyloid beta，Aβ)

APP基因位于21q21.1 ～21.3，约为300 kb，含有19 个外显子。由该基因编码的蛋白——APP，经β-分泌酶和γ-分泌酶水解生成Aβ 片段，后者是AD患者脑中SP 的主要成分。体内外实验证实，Aβ 具有很强的神经毒性，可以诱导细胞凋亡。AD 的发生与Aβ 的过度生成及在脑内大量沉淀、堆积有关。Aβ 是各种因素诱发AD 的共同通路，是AD 形成和发展的关键因素。Aβ 主要有2种形式，一种是由40 个氨基酸残基组成的蛋白片段，称之为Aβ40，另一种是由42 ～43 个氨基酸残基组成的蛋白片段，称为Aβ42。研究发现，Aβ42比Aβ40多2 个疏水性氨基酸而具有更高的凝聚能力，更容易在AD 患者的脑中形成SP。

1.1.1 脑脊液中的Aβ 早期对Aβ40的定量检测结果并不理想，大部分研究显示，AD 患者脑脊液中Aβ40的水平往往不变或轻度升高［1]。另有研究表明，由于Aβ 寡聚化造成的抗原表位被掩盖或Aβ 结合了载体蛋白，导致ELISA 等方法无法检测到Aβ40水平的真实变化，只有使用金属离子亲和层析法才能检测到脑脊液中Aβ40水平的显著升高［2]。

大多数研究表明，与健康对照组相比，AD 患者早期脑脊液中Aβ42浓度降低约50%，甚至在MCI 阶段就可以见到Aβ42浓度的降低，因此，对AD 患者进行脑脊液Aβ42定量检测有助于AD 的早期诊断［3]。虽然脑脊液中Aβ42水平的降低可以将AD 患者与健康对照组正确区分开，但是，Aβ42水平的降低并不能将AD 与脑内具有Aβ 沉积的其他疾病区分开，如路易体痴呆、额颞叶痴呆和血管性痴呆等［4]。因此，将Aβ42作为AD 生物标志物，其特异性并不高。脑脊液中Aβ42水平降低的确切原因尚有待于进一步研究。

研究证实，AD 或MCI 患者脑脊液中Aβ40/Aβ42的比值较健康对照组明显升高，该指标与上述AD患者早期脑脊液Aβ42浓度降低约50%联合应用可以将AD 和非AD 型痴呆很好地鉴别开，对AD 的早期诊断更具有临床价值。Kanai 等［5]和Wiltfang等［6]研究也都证实了这一结论，即在预测MCI 发展成为AD 方面，Aβ40/Aβ42的比值比单独检测Aβ42水平更有意义。

1.1.2 血液中的Aβ 由于血液标本易采集，故针对血液中AD 的生物标志物研究较多。对于AD 患者血浆中Aβ40和Aβ42水平的检测，其结果也不尽相同。部分研究发现，AD 患者血浆Aβ40水平显著高于对照组［7];另有研究表明，在临床前期，AD 患者血浆中Aβ42浓度明显降低［8];然而，大多数研究表明，AD 患者早期阶段血浆中Aβ40和Aβ42并无明显变化，故血浆Aβ40和Aβ42水平的检测对AD 的早期诊断并无意义［9]。彭丹涛等［10]研究证实，家族性AD 患者血浆Aβ42水平较对照组显著升高，随着疾病的进展，Aβ42水平逐渐降低，因此，Aβ42水平的变化要早于临床症状的发生;而血浆中Aβ40水平与对照组比较，差异无统计学意义。这些实验结果的不同可能与血浆中Aβ 水平较低、影响血浆Aβ 代谢的肝肾功能及影响血浆Aβ 来源的外周组织(如骨骼肌可产生Aβ)有关。因此，血液中Aβ 水平作为AD早期诊断的生物标志物缺乏足够的稳定性和可靠性，对AD 的临床诊断缺乏应用价值。研究发现，由Aβ42聚集形成的可溶性Aβ 寡聚体是产生神经毒性的主要形式［11]。Aβ 寡聚体能够特异地与某些突触相结合，进而引起突触结构损伤和认知功能障碍。值得注意的是，这种损害在AD 的早期阶段就已经出现，因此，对可溶性Aβ 寡聚体的检测可能更具有临床诊断意义。

鉴于AD 患者脑内有Aβ 的沉积，推测AD 患者可能存在清除Aβ 的免疫缺陷，因此，针对抗Aβ 自身抗体也有大量的研究。研究显示，AD 患者血清中抗Aβ 自身抗体的水平较健康对照组明显升高［12-13]。Marcello 等［14]分析AD 患者与健康对照组外周血中不同Aβ 亚型(Aβ1-42、Aβx-40、Aβx-42和AβpE3)的抗Aβ 抗体，结果显示，两组除抗AβpE3 抗体有差异外，其他并无明显差异。另有研究发现，抗Aβ 寡聚体抗体在中重度患者中的水平显著高于轻度AD 患者［15]，提示其可用于AD 疾病进程的诊断。目前，关于AD 患者血浆中抗Aβ 自身抗体的变化仍有争议，仍需更深入地进行研究。

1.1.3 血小板中的APP 在血小板中，完整的APP被加工成3种异构体，相对分子质量分别为130000、110000和106000。研究显示，APP 异构体的代谢变化与AD 的发病过程有着重要相关性［16]。Mukaetova-Ladinska 等［17]对血小板中的APP 进行检测，发现其含量与认知程度呈负相关。高分子量的APP 异构体(130000)与低分子质量的异构体(110000 与106000 之和)的比值称为APP 异构体比值。研究表明，AD 患者血小板中该比值低于健康对照组，并且与疾病的严重程度和进程存在着一定的关联，该比值可以作为AD 的有效生物标志物［18-19]。

1.2 tau 蛋白

tau 蛋白是一种微管相关蛋白，起到促进微管形成、稳定神经元的作用。在AD 患者脑内，tau 蛋白发生异常磷酸化、糖基化后形成配对螺旋纤维(paired helical filaments，PHFs)，进一步形成NFTs。

在NFTs 形成早期，总tau 蛋白(total tau proteins，t-tau)和水溶性磷酸化tau 蛋白(phosphorylated tau proteins，p-tau)可以通过病变神经元的细胞膜进入脑脊液中。研究显示，中重度AD 患者脑脊液中t-tau 水平较健康对照组高2 ～3 倍［20];虽有研究发现t-tau 升高水平与疾病进程无关，但在AD 发病早期就检测到t-tau 的升高［21-22]，因此，t-tau 可以用于AD 的预测。然而Gloeckner 等［23]对106例包括AD、皮质-脊髓-纹状体变性、Lewy 痴呆、额颞叶痴呆以及正常压力脑积水及健康对照组脑脊液中t-tau 蛋白进行定量分析，结果显示，所有受试者脑脊液中t-tau 水平都显著增高，因此，t-tau 单独用于AD 的诊断尚缺乏特异性，不能作为区分其他神经系统疾病的特异性生物标志物。

P-tau 是形成NFTs 的主要物质。研究发现，AD患者体内tau 蛋白至少有25 个异常磷酸化位点［24]，这些位点主要位于与微管结合的181-235 和369-422氨基酸位点。因此，过度磷酸化易导致tau蛋白与微管结合能力下降。目前研究较多的是p-tau 181、p-tau 199 以及p-tau 231，这三者的水平均高于健康对照组，而且分别能很好地鉴别AD 与皮质-脊髓-纹状体变性、Lewy 痴呆与额颞叶痴呆。其中，p-tau 231 鉴别AD 与其他痴呆类型的灵敏度和特异性高达85%和97%［25]。另有研究发现，对于急性脑血管病等非特异性脑损伤患者，t-tau 含量升高，但p-tau 含量并未升高，这更说明p-tau 具有特异性。对AD 和其他痴呆疾病的诊断，p-tau 具有较高的灵敏度和特异性。

1.3 载脂蛋白

1.3.1 载脂蛋白E(ApoE) ApoE 是一种与胆固醇类物质运输相关的血浆蛋白，主要在肝脏合成和分泌，其次在大脑。ApoE基因具有多态性和遗传上的异质性，它在同一基因位点上有3 个等位基因:ε2、ε3和ε4;分别编码3种蛋白:ApoE2、ApoE3 和ApoE4，其中，ApoE4 最不稳定，具有很高的致病活性。研究发现，ApoE 与家族性AD 和散发性AD 均有很大关联，ε4能够提高患AD 的风险;同时在SP和NFTs 中均含有ApoE4，并且与Aβ 的结合能力明显强于ApoE2 和ApoE3。Ma 等［26]研究发现，ApoE在与Aβ 相互作用的过程中，ApoE4 比ApoE3 更能促进NFTs 的形成，而ApoE2 能够有效地预防Aβ 的聚集。Fagan 等［27]研究表明，ApoE4 不是导致Aβ沉积的必要因素，但能够促进可溶性Aβ 形成沉淀。目前，关于ApoE 与Aβ 的作用机制尚不清楚，但值得肯定的是，ApoE 与Aβ 的产生存在着很大关联。现在普遍认为ApoE4 与Aβ 共沉淀，加速了Aβ 的聚集，提高了患AD 的风险;而ApoE2、ApoE3 可以抑制Aβ 的聚集，起保护作用。

研究发现，ApoE3 能够与未被磷酸化的tau 蛋白结合，从而防止tau 蛋白的过度磷酸化;然而ApoE4 与tau 蛋白的亲和力较差，不能防止tau 蛋白的过度磷酸化［28]，致其形成双螺旋丝，随后发展为NFTs，最终引起AD 的发生。Hoe 等［29]研究证明了类似结论:ApoE2 能够降低tau 蛋白的磷酸化，而ApoE4 则促进tau 蛋白的磷酸化。由于AD 患者ApoE4 升高且具有较高的特异性，随着研究的深入，ApoE4 将成为一种用于AD 诊断的重要的生物标志物。

1.3.2 载脂蛋白J(ApoJ) ApoJ 又称簇集蛋白，在血浆中含量较多。血浆ApoJ 水平与AD 存在相关性。研究［30-31]发现，血浆ApoJ 含量高的AD 患者，其嗅皮质、颞上回萎缩速度明显减慢;也有研究发现，血浆ApoJ 值与内嗅皮质(特别是右侧内嗅皮质)Aβ 呈显著负相关。ApoJ 可能通过某种途径或机制对AD 的病理生理进程起到保护作用。上述研究均揭示ApoJ 作为一种AD 生物标志物的巨大潜能。

1.4 炎症性的生物标志物

炎症反应在AD 的发病中起着重要作用。研究表明，AD 患者外周血中的白细胞介素(interleukin，IL)1、4、6、10、12、16 和18，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)与健康对照组比较，差异有统计学意义，尤其是IL-6、10、12、18，TNF-α 和TGF-β 的水平均升高［32]。另有研究发现，伴有严重的认知功能损害的AD 患者，其血浆中TNF-α 的水平较低［33]。研究发现，AD 患者TNF-α 受体TNFR1 血清水平明显高于健康对照组［34]。因此，与炎症反应相关的细胞因子对AD 的诊断及预防可能具有一定的指导意义。

1.5 生物学上的功能性金属

金属离子内部稳态的紊乱与AD 等几种神经性病变有关。研究发现，在AD 患者大脑内的Aβ 沉淀中，锌、铜、铁的含量较高。AD 患者血清中锌浓度显著低于健康对照组，而铁和铜浓度没有显著的差异［33]。推测可能是由于锌与AD 患者大脑中的Aβ和(或)APP 相结合而致其在血清中的水平下降。尽管如此，目前关于AD 患者血清中生物金属浓度改变的观点尚未达成一致，仍需要进一步的研究。

1.6 晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)

近来研究发现，AD 发病机制与胰岛素信号转导通路异常密切相关，而且糖尿病患者较健康人更易患AD;因此，相关的AD 生物标志物也不断地被发现。AGEs 是一种具有细胞毒性的物质，随着病程的发展在糖尿病患者体内不断堆积，在AD 患者的SP 和NFTs 中均能检测到。AGEs 与AD 的发病机制相关，参与了AD 的病理形成，最终导致神经元坏死;因此，AGEs 可能成为用于AD 早期临床诊断的生物标志物。

1.7 阿尔茨海默病相关神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)

AD7c-NTP 是一种跨膜磷蛋白，可能成为AD 早期临床诊断的生物标志物之一。在AD 患者的脑脊液和尿液中均可检测到AD7c-NTP，并且其水平的高低与痴呆的严重程度呈正相关，而与年龄和性别无关［35]。研究表明，AD 患者脑脊液和尿液中的AD7c-NTP 水平明显高于健康对照组［36-37]，并且中晚期AD 患者AD7c-NTP 水平要明显高于早期AD患者［37]。鉴于AD7c-NTP 在早期AD 患者的脑脊液和尿液中均表现为升高，且尿液检测无创、方便，因此，检测AD 患者尿液中的AD7c-NTP 水平具有诊断早期AD 的临床应用价值。

2 其他AD 相关生物标志物

除上述生物标志物外，还有大量关于AD 生物标志物的报道:①异前列腺素(8，12-iso-iPF2α-VI isoprostane，IP)是脂膜氧化损伤产生的物质，在MCI 和AD 患 者 的 脑 脊 液 中 呈 高 表 达［38-39];与Aβ1-42、p-tau 相比，IP 是唯一随着随访时间延长表达水平增高的标志物。②研究发现，MCI 和AD 患者的脑脊液中β-位点淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的浓度和活性较健康对照明显升高。BACE1 是促使APP 裂解成Aβ 最主要的β-分泌酶，其活性与脑脊液中t-tau 蛋白水平呈正相关［40]。③近来研究显示，miRNA 在神经退行性疾病中起着重要作用，如BACE1 基因的miRNA-29a/b-1 在AD中的表达明显降低，其缺失使BACE1 蛋白的表达明显上调，最终导致Aβ 的积累，直至引发AD［41]。随着进一步研究，miRNA 有可能成为AD 诊断的生物标志物之一。④蛋白质组学和代谢组学的发展，为寻找AD 血液的生物标志物提供了巨大的帮助，相关的异常物质如表皮生长因子、溶血磷脂酰胆碱、色氨酸等相继被发现。由于各实验室的实验方法和技术存在着很大差异，且这些标志物与AD 的病理生理关系还需进一步明确;因此，上述具有潜在应用价值的标志物应用于临床诊断还需要更深入的研究。

3 总结与展望

关于AD 早期诊断的体液生物标志物的研究已有很多，但迄今尚未发现一种确定的、可靠的生物标志物。脑脊液中Aβ 以及tau 蛋白的研究已取得了较大的成就，对AD 的临床诊断具有一定的应用价值。但是，脑脊液的采集对患者会造成一定的创伤，而且采集的适应证、禁忌证以及技术性都限制了腰椎穿刺的广泛应用。由于血液采集创伤较小、简单易操作，因此，对血液中AD 生物标志物的研究更具有临床意义。

寻找一种能及早、准确地检测到AD 的特异性分子病理学改变的生物标志物，还需要更深入的研究。随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学的发展，以及对外周血单个核细胞的深入研究，我们将会发现更多的与AD 相关的基因及其功能蛋白，进而开发出具有高灵敏度和高特异性的生物标志物。

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