“温阳补气”针法对EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影响

王洪峰 吴 瑶 张立娜 (长春中医药大学研究生学院，吉林 长春 307)

“温阳补气”针法对EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影响

王洪峰 吴 瑶 张立娜1(长春中医药大学研究生学院，吉林 长春 130117)

目的 探讨“温阳补气”针法对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠血清中转化生长因子(TGF)-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达水平影响的作用机制和效果。方法 采用AChRα1 129-145多肽片段免疫接种雌性Lewis大鼠，建立EAMG大鼠动物模型;随机选取建模成功的EAMG大鼠30只，分成针灸治疗组、药物对照组、模型对照组各10只，并将同期购进未建模的10只大鼠设为空白对照组;针灸治疗组予以“温阳补气”针法治疗，药物对照组予以溴吡斯的明灌胃治疗，其余两组不予任何特殊处置，仅作对照观察;治疗结束后，从四组大鼠尾根静脉采血，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定大鼠血清中TGF-β、TNF-α的含量。结果 治疗结束后，针刺治疗组EAMG大鼠血清中TNF-α的表达水平显著降低，与模型对照组相比差异显著(P＜0.05);TGF-β的表达水平明显升高，与模型对照组相比差异显著(P＜0.01)。结论 “温阳补气”针法治疗MG的疗效良好，可通过调节TNF-α和TGF-β的表达水平而发挥治疗MG的作用。

针灸;实验性自身免疫性重症肌无力;TGF-β;TNF-α

重症肌无力(MG)主要是由乙酰胆碱(Ach)受体(AchR)抗体(AchR-Ab)介导的细胞免疫依赖和补体参与的神经肌接头部位自身免疫性疾病。中医学认为本病属于“痿证”的范畴，笔者在临床中以温阳补气为主要治疗原则，采用针灸疗法治疗本病取得了良好的临床疗效。为进一步分析“温阳补气”针法治疗MG的作用机制，本文探讨“温阳补气”针法对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠血清转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雌性Lewis大鼠80只，6～8周龄，平均体重(162.21±4.7)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供〔合格证号码:SCXK(沪)2007-0005〕，检疫后送至长春中医药大学实验动物中心，标准大鼠颗粒饲料喂养。

1.2 主要试剂和仪器 AchRα1 129-145多肽片段(美国Sigma公司)，大鼠 AChR-Ab 、TNF-α、TGF-β ELISA 检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司)，60 mg/片溴吡斯的明(上海三维制药有限公司)，Σ960型全自动酶标仪(美国Metertech公司)，T-500型电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司)，GS-15R低温高速离心机(美国Beckman公司)，微量加样器(日本Nichiryo公司)，0.25×25 mm毫针(苏州医疗用品厂有限公司)，艾绒(南阳绿莹艾草生物制品有限公司)。

1.3 造模方法 选取SPF级Lewis大鼠60只，采用免疫接种法建立EAMG大鼠动物模型，将AChRα1 129-145多肽片段按照1∶2的比例与弗氏完全佐剂(CFA)完全乳化，配比按照200μl溶液内含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)定容至20 ml，充分混匀制成免疫乳剂，取一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散作为乳化好的标志。首次免疫接种时，将上述抗原乳剂以 300μl/只(含 AChRα1 129-145:75μg)多点注射于大鼠四肢足垫部、尾根部、背部。在首次免疫后第4、8周，分别进行强化免疫接种，将AChRα1 129-145多肽片段以1∶2的比例与弗氏不完全佐剂(IFA)完全乳化，配比按照200μl溶液含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的PBS液定容至 20 m l，以200 μl/只(含 AChRα1 129-145 50 μg)多点注射于大鼠四肢足垫部、尾根部、背部。以Lennon分级评分≥1分，同时AChR-Ab为阳性，视为EAMG大鼠模型造模成功。

1.4 分组及治疗方法 选取建模成功的EAMG大鼠30只，随机分成针灸治疗组，药物对照组，模型对照组各10只;此外，选取同期购进未建模的SPF级Lewis大鼠10只设为空白对照组。针灸治疗组予以“温阳补气”针法治疗，手三里(双)直刺5 mm，足三里(双)直刺6 mm，脾俞(双)直刺6 mm，肾俞(双)直刺6 mm，平补平泻，针上加灸，30 min/次，1次/d，7次为 1个疗程，疗程间休息1 d，连续治疗2个疗程。药物对照组予以溴吡斯的明灌胃治疗，根据《药理实验方法学》计算出EAMG大鼠溴吡斯的明给药量为18.5 mg/kg，将药物溶于蒸馏水中，灌胃给药，1次/d，连续治疗15 d。模型对照组和空白对照组，同等条件下饲养，抓取1次/d，观察一般情况，不予特殊处置。

1.5 检测方法 治疗结束后，大鼠尾根静脉采血，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中TGF-β、TNF-α的含量。

1.6 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，组间比较采用单因素多样本均数比较。

2 结果

2.1 一般情况 从首次免疫接种后，造模大鼠约在第4周之后逐渐开始出现症状，如活动减少、动作减缓、挣扎力量减弱、叫声降低、毛发变暗等，在第2～3次强化免疫接种之后，上述症状逐渐加重。在造模过程中，共死亡大鼠3只，均因MG过重死亡。在首次免疫接种后的第9周，存活的57只大鼠中，共有31只大鼠Lennon评分≥1分，且AChR-Ab检测为阳性。

2.2 “温阳补气”针法对EAMG大鼠血清TNF-α表达水平的影响 造模成功后，模型对照组大鼠血清中TNF-α的表达水平显著升高，与空白对照组比较具有极显著性差异(P＜0.01)。经治疗后，针灸治疗组和药物对照组大鼠血清中TNF-α的表达水平均明显下降，针灸治疗组与模型对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)，药物对照组与模型对照组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，但针灸治疗组疗效与药物对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.3 “温阳补气”针法对EAMG大鼠血清TGF-β表达水平的影响 造模成功后，模型对照组EAMG大鼠血清中TGF-β的表达水平明显降低，与空白对照组比较具有极显著性差异(P＜0.01)。经治疗后，针灸治疗组和药物对照组EAMG大鼠血清中TGF-β的表达水平均明显升高，与模型对照组相比均具有极显著性差异(P＜0.01)，但针灸治疗组疗效与药物对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、TGF-β表达水平(±s，n=10)

表1 各组大鼠血清TNF-α、TGF-β表达水平(±s，n=10)

与模型对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05

组别 TNF-α TGF-β空白对照组 49.976 5±9.891 51) 509.780 3±22.840 51)模型对照组 89.122 5±11.738 6 196.015 2±14.225 5针灸治疗组 76.724 5±6.853 82) 424.007 6±35.471 61)药物对照组 72.928 6±9.683 71) 438.037 9±41.029 81)

3 讨论

干扰素、白介素(IL)、TNF-α、TGF-β等细胞因子都与MG的发生有着密切的联系。TGF包括TGF-α和TGF-β两大类，TGF-β是一种重要的内源性免疫抑制性因子，可以抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和分化，抑制Th1、Th2细胞产生干扰素(IFN)-γ、IL-4等，TGF-β可抑制AchR诱导炎性因子的产生，在MG的发病过程中具有重要的作用〔1〕。张栩等〔2〕研究发现，随着MG患者病情的缓解和稳定，其体内内源性免疫抑制功能得到增强，TGF-β在抑制MG及EAMG的发病和诱导免疫耐受中具有重要的作用。刘江恒等〔3〕在利用骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗EAMG大鼠时发现，BMSCs可以通过TGF-β的分泌影响AChR特异性Th17/Treg细胞亚群的分布及其相关因子的分泌，证明TGF-β可以缓解EAMG大鼠的病情。TNF可分为TNF-α和TNF-β两种，其中TNF-α常被称为前炎症性细胞因子，主要由单核-巨噬细胞分泌，具有促进胸腺细胞活化和增殖的作用，还可以促进IL-1、IL-2的产生，从而启动Th1类细胞反应。有学者发现〔4，5〕MG患者早期血清中TNF-α的含量明显升高，且病情越严重含量越高，治疗效果越差;也有学者〔6〕发现MG患者在治疗前血清TNF-α的水平与正常人无显著差异，但患者体内TNF-α的分泌功能处于待发或激动状态，说明MG患者血清中TNF-α的表达水平虽然尚不能作为判断MG病情的指标，但是TNF-α与MG的发生和发展具有密切的关系。

“温阳补气”针法根据MG患者脾气虚弱、肾阳不足的病机特点，以手三里、足三里、脾俞、肾俞为主要治疗穴位，旨在温阳补髓、益气养血、濡润宗筋，以达到补气助力、壮肌治痿，对MG具有良好的治疗作用。本研究结果说明TNF-α和TGF-β均参与了MG的发病过程，且具有重要的作用;另外针灸疗法具有调节TNF-α和TGF-β的表达水平治疗MG的作用，且其疗效与药物治疗相近。由此可推断:“温阳补气”针法对MG具有良好的治疗作用，其作用机制与调节TGF、TNF等细胞因子的表达水平，改善自身免疫功能存在密切的关系。

1 Wany ZY，Link H，Ljungdahl A，etal.Induction of IFN-γ，IL-4 and TGF-βin rats orally to lerized against experimental autoimmune myasthenia gravis〔J〕.Cell Immunol，1994;157(2):353-68.

2 张 栩，孙兆林，丛志强，等.重症肌无力病人外周血单个核细胞TGF-β及IL-6水平的测定〔J〕.青岛大学医学院学报，2003;39(4):386-8.

3 刘江恒，韩志娟，周明言，等.转化生长因子-β在骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性重症肌无力机制中的作用〔J〕.中国生物制品学杂志，2010;23(3):225-9.

4 张晓明，李新立，肖建军，等.重症肌无力病情与血清IL-6、TNF-α的关系〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2008;11(11):25-7.

5 胡 军，阮丽荣，张清勇，等.重症肌无力患者外周血单个核细胞Fas及血清 sFas、TNFα 检测〔J〕. 郑州大学学报(医学版)，2005;40(1):4-6.

6 管宇宙，崔丽英，李延峰.100例重症肌无力患者肿瘤坏死因子-α分泌活性的研究〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2004;11(4):187-90.

The study of“warm ing yang and nourishing qi”acupuncture on the serum expression level of TGF-β and TNF-α of EAMG rats

WANG Hong-Feng，WU Yao，ZHANG Li-Na.
Graduate School，Changchun University of Chinese M edicine，Changchun 130117，Jilin，China

Objective To observe the influence of“warming yang and nourishing qi”acupuncture treatment on the serum expression levels of TGF-β and TNF-α of EAMG rats，and analyze themechanism.M ethods AChRα1 129-145 peptide fragmentswas used to immune Lewis female rats，establish EAMG ratmodels.The successful EAMGmodel ratswere divided into acupuncture treatment，drug control，model controlgroups，each group had 10 rats;the unmodelled 10 ratswhich were purchased at the same period were set to blank control group.The acupuncture treatment group was given“warming yang and nourishing qi”acupuncture treatment，the drug controlgroup was given pyridostigmine.After treatment，the serum expression levels of IL-12 and IL-18 were tested by ELISA.Results After treatment，the serum expression level of TNF-α was significantly reduced，and the level of TGF-β was increased in acupuncture treatment group than that of model control group(P ＜0.05，P ＜0.01).Conclusions The“warming yang and nourishing qi”acupuncture has good therapeutic effect through adjusting the expression levels of TNF-α and TGF-β.

Acupuncture;Experimental autoimmunemyasthenia gravis;TGF-β;TNF-α

R245

A

1005-9202(2013)23-5884-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.23.049

国家自然科学基金资助项目(No.81173344)

1 长春中医药大学针灸推拿学院

王洪峰(1971-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事针灸治疗神经系统疾病的临床与效应机制研究。

〔2012-06-25收稿 2012-09-15修回〕

(编辑 袁左鸣)