干细胞在工程化组织构建与再生中的应用

吕静静 於学禅 沈秋霞 竺亚斌

(宁波大学医学院，宁波 315211)

引言

现在每年都有成千上万的患者因各种疾病，导致组织和器官损伤或功能丧失，严重威胁着人们的身体健康，需要重建或移植。然而因为道德伦理、传统思想以及自身再生能力薄弱、异体间存在免疫排斥等各种原因，在体外重建出紧缺的组织或器官已经迫在眉睫。组织工程与再生医学就是利用组织再生的各种方法和技术重建出结构性和功能性的人工组织器官，以修复或更新受损、坏死组织器官的科学［1］。它为组织器官损伤或功能衰竭的患者们带来了巨大的希望，有着广阔的临床应用前景。成功构建组织工程的三大要素是种子细胞、支架材料和三维构建，其中最基本、最核心就是种子细胞的选择。目前，种子细胞的来源很多，如自体细胞、同种异体细胞或异种细胞等。但是这些种子细胞有着自身难以克服的缺点，大大降低了其在组织工程中应用的可行性，或者根本无法满足人为构建工程化组织器官的需要。如自体细胞来源数量有限，在短时间内体外扩增困难，并常伴有去分化现象;同种异体或异种细胞容易引起病原体感染、具有免疫排斥等问题［2］。

近些年的研究发现胚胎干细胞在一定条件下可以分化成人体几乎所有的细胞［3-4］;成体干细胞如间充质干细胞等同样也具有分化成其他细胞或组织的潜能［5］。干细胞的这种定向分化潜能使其成为了比较理想的种子细胞。另外，干细胞具有很强的自我更新及定向分化能力，在细胞来源、增殖、定向分化及重建器官的植入等方面均具有较明显的优势，在组织工程及临床应用上有着重要的应用价值，因此干细胞是一种较为理想的种子细胞。现在干细胞作为种子细胞在组织工程中的研究已然成为当前生命科学的焦点，为攻克困扰人们的各种疑难杂症带来了希望。干细胞包括胚胎干细胞和体细胞来源的干细胞，已经用于组织工程构建的干细胞种类有胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞等。本文结合国内外最新研究进展综述了胚胎干细胞、间充质干细胞的基本情况和发展现状，综述了诱导多能干细胞作为组织工程研究的种子细胞的应用和最新进展，同时总结了现在研究中存在的困难和问题，对于干细胞相关研究的深入开展和具体实施具有重要指导意义。

1 胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)是在胚胎发育早期-囊胚(受精后约5 ～7 d)的内细胞团中的细胞，能大量繁殖并保持未分化状态，也可以分化成三个胚层中的任意一种细胞［4，6］，有着其他来源干细胞不可比拟的优势，也因此成为各种组织和器官修复中引人注目的种子细胞。1981 年，英国Evans、Kaufman 和美国Martin 建立了最早的小鼠胚胎干细胞系［7-8］。此后，一系列其他动物的胚胎干细胞系也相继建立起来。体外分离获取胚胎，培养“巢状”生长的胚胎干细胞系已不再是困扰ESC 研究的难题，定向诱导分化为组织工程提供新的种子细胞则成为了新的研究热点。

目前对ESC 向血管内皮细胞、平滑肌细胞、肌细胞、角膜上皮细胞甚至神经细胞等的体外分化已取得了可喜的成果，初步建立了一些体外诱导分化的技术和体系，并发现了一些特异的诱导分化物质。ESC 体外诱导分化为特定组织细胞常选用三种策略:EB(拟胚体)分化方式、与成熟细胞或成纤维饲养层共培养以及添加化学试剂等。2010 年，Nourse 采用 EB 方法，运用血管内皮生长因子(VEGF)促进ESC 向血管内皮细胞分化，而不受细胞密度的影响［9］。然而这一方法的分化效率较低，如内皮细胞分化仅为1% ～3%［10］，向平滑肌细胞分化也只是10%［11］。此外，由EB 方法分化得到的血管细胞还掺杂许多其他类型的细胞。国内研究者岳伟在此基础上利用免疫磁珠(FACS)、流式细胞仪(MACS)等分选出Flk-1 阳性的血管前体细胞，然后在VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)的诱导培养下，得到了构建成熟血管的内皮细胞和平滑肌细胞［12］。最近一些可以提高血管细胞分化效率的改进EB 法被陆续报道，如:在细胞培养液中添加生长因子VEGF-A［9］或BMP4(骨形成蛋白)［13］，结合细胞外基质环境作用［14］或者阻断TGF - β 通路［15］等。此外，在培养板上包被胶原蛋白IV［16］、纤维黏连蛋白［17-18］也能不同程度地提高ESC 分化成血管细胞的产率和质量。令人惊喜的是Kane 发明的一种无血清分化方式，使内皮细胞的分化效率达到81. 59% ±2. 11%［19］，Blancas 证实纤维黏连蛋白比胶原蛋白IV 更有利于ESC 的分化［15］。

研究证实ESC 也可以诱导分化为包括心房肌、心室肌、窦房结样细胞等多种心肌细胞。Gold 和Matsuura 等让 ESC 在体外分别接受二甲亚砜(DMSO)、新霉素以及明胶的处理发现ESC 具有心肌细胞的典型特征:有节律的自发收缩，甚至有肌管的形成［20-21］。Mummery 等将ESC 与内脏内胚层细胞(也叫VE-样细胞)共培养也诱导出了心肌细胞［22］，这些充分证明了ESC 可以为心肌再生提供种子细胞。最近Sanford-Burnham 医学研究所、人类生物大分子研究所和ChemRegen 公司的研究人员合成的ITD -1 分子十分有利于ESC 分化为心肌细胞，大大提高了ESC 诱导分化的效率［23］。

人ESC 在胶原蛋白Ⅳ和角膜缘成纤维细胞的作用下，可以成功诱导出类角膜缘上皮细胞并表达出角膜上皮细胞特异标志物CK13 及CK12，部分表现出上皮细胞的功能［24］。视黄酸(RA)诱导ESC向多种神经细胞如神经元分化［25］;胎牛血清促进ESC 向造血干细胞分化［26］;在BMP2 和BMP4 的作用下，ESC 也可以生成软骨的主要细胞如软骨形成细胞［27］。通过上述的研究成果进一步明确了ESC可以作为组织工程理想的种子细胞，参与下一步的器官再生与组织修复。

毫无疑问，人们对ESC 的定向诱导分化有了长足的认识，能够创造出越来越多的具有宝贵价值的细胞应用于临床实践。但是ESC 研究领域有许多我们现今无法解决的难题:体外培养要求严格，ESC向特定细胞分化的机制不明，体内致瘤性高，临床应用面临着法律、伦理和道德等问题，如果这些困难得以解决，ESC 将成为组织工程领域优秀的“种子细胞库”。

2 间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，因能分化为间质组织而得名。与ESC 相比MSC 有着自己独特的优势:(1)来源广泛，遍布在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中;(2)能抑制免疫应答，异体移植不会发生排斥反应，移植成功率显著增加;(3)具有造血支持、免疫调控和促干细胞植入的能力［28］;(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。目前MSC 的分离方法主要有全骨髓直接贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠负筛选法等。大多数采用的是密度梯度离心法与贴壁培养法或免疫磁珠负筛选法相结合的方法，获得了纯度较高的MSC［29］。

近年来的研究表明MSC 虽来源于中胚层，却可以分化出多种内胚层和外胚层组织细胞，如食管、骨、软骨、脂肪、心肌、血管内皮、神经等多种组织细胞。食管黏膜损伤如对骨髓MSC 具有招募和趋化性，哈伟杰等将MSC 注射到食管损伤的大鼠体内，发现MSC 大多分布在食管粘膜下层和基层内，可以形成食管主要细胞［30］。Tan 将复合MSC 的小肠粘膜下层支架原位替换部分犬食管，术后4 周发现缝合处上皮层几乎全部形成，且有成束的骨骼肌细胞，毛细血管密布［31］。Păunescu 等用上皮生长因子、角质细胞生长因子、干细胞生长因子、胰岛素样生长因子-II 成功的将MSC 诱导成了食管上皮细胞［32］。Sarosi 等将MSC 经尾静脉注射到用致死量光照辐射的大鼠体内，10 d 后大鼠随机地接受反流式食管炎手术及食管空肠吻合手术，8 周后伤口处呈现出鳞状上皮细胞和柱状上皮细胞［33］。zhang 等在PLGA 材料上种植基因修饰的MSC，植入体内4周后，免疫荧光显示部分 MSC 分化为平滑肌细胞［34］。

2010 年，张波等灌注培养接种在HA/PLA(羟基磷灰石接枝聚乳酸)纳米复合多孔支架上的MSC，15 d 后检测到骨组织ALP 活性明显增强［35］。Partridge 等将转染了Ad-BMP -2 的MSC 与多孔的PLGA(聚乳酸羟基乙酸)复合培养6 周后，经矿化物、碱性磷酸酶检测证实MSC 已向成骨细胞分化并且可以维持成骨细胞表型;将细胞支架复合物移入动物体内也出现分化现象并产生了部分骨组织［36］。Gao 等将成软骨条件诱导的大鼠骨髓MSC，复合透明质酸或磷酸钙的支架植入裸鼠背部皮下，一周后发现新生组织中含有Ⅰ、Ⅱ型胶原，认为骨髓MSC结合相应的支架材料可以分化出软骨细胞构建人工软骨［37］。Kang 等将复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA 支架的MSC 移植到大鼠的脊椎损伤模型中，发现MSC 利用三维支架可以修复脊椎横切面的损伤［38］。Sekiya 等的实验表明控制镁离子浓度有效地促进滑液MSC 向软骨细胞分化［39］。Hwang 等将复合在聚乳酸或丙交酯和ε-己内酯共聚物的高分子支架材料上的脂肪MSC 与软骨细胞共培养，发现MSC 可以促进软骨细胞的增殖速度和基质形成，而具有软骨细胞的微环境则能够诱导MSC 向软骨细胞定向分化［40］。

李春明等将脂肪MSC 与丝素蛋白支架复合物移植到Wistar 大鼠后肢肌肉，8 周后发现支架网内成脂样细胞明显增多并融合片状生长［41］。Cui 和他的同事们将MSC 与D1 细胞共培养发现地塞米松可以诱导MSC 向脂肪细胞分化［42］。Neubauer 等将接种在PLG 支架上的大鼠MSC 置于含bFGF 的培养基中一段时间后，在支架材料上检测到了高密度的脂肪细胞和氢化酶［43］。

Wang 等将DAPI 标记的鼠MSC 注入其他小鼠心肌中，术后检测到MSC 向心肌细胞分化［44］。另外，Tang 和他的同事发现过量的旁分泌因子如SDF、VEGF、HGF 和IGF 促进MSC 向心肌细胞的分化［45］。Quevedo 和Hatzistergos 将MSC 注射到心肌缺损模型中，术后一段时间后发现MSC 迁移到了损伤部位，其边界分化出了心肌细胞，并且提高了射血分数EF［46-47］。Shafy 等将MSC 种植到胶原蛋白包被的支架上，培养出了有节律跳动的心肌细胞，移植到体内同样提高了EF，同时增强了心肌的收缩功能以及抵御心室壁的病理性减薄［48］。

Ishii 等将用含脂质体的磁性纳米颗粒培养的MSC 注射到后肢缺血模型的裸鼠中，术后检测到新生血管中含有血管内皮生长因子，同时恢复了血液循环［49］。Silva 等将MSC 注射到犬心脏后，观察到大量丛生的血管，免疫组化检测到上皮细胞、内皮细胞等标志性蛋白［50］。2008 年，Melero-Martin 将MSC 与血管内皮祖细胞共培养，一周后MSC 诱导分化形成了大量的血管细胞［51］。

Choong 等发现MSC 可以迁移到角膜组织中形成具有角膜基质细胞表型的细胞［52］。Chen 等将骨髓MSC 静脉注射到脑损伤模型的实验动物中，观察到MSC 可以迁移至大脑，分化出神经样细胞［53］。Wang 等观察到将MSC 复合到由羟基丁酸、羟基戊酸、羟基已酸三元共聚物的支架上可以促进向神经细胞的分化［54］。MSC 还可以成功诱导出许多其他类型的细胞，移植到体内分化出皮肤、肺等多种组织。这些研究结果揭示MSC 完全可能作为组织工程的种子细胞用于各种组织器官的构建和功能修复。

可是目前将间充质干细胞应用于临床，仍有很多问题尚待解决:MSC 的分化进程与其增殖能力负相关;MSC 来源不一，这些细胞的增殖、分化能力也大不相同，几次传代后，这种差异尤其明显，无法满足组织工程细胞数量的要求。

3 诱导多能干细胞

近些年的研究表明诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)是获取组织工程种子细胞的另一新途径，由于它不存在类似ESC 和MSC 的来源问题，成为了当前研究的热点。iPS 的生物学特性、增殖特点及分化潜能类似胚胎干细胞，可以由单个细胞分化为内胚层、中胚层和外胚层所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。2006 年Takahashi 将外源基因oct4、sox2、c-myc 和k1f4 导入皮肤成纤维细胞首次获得了iPS，此成果被发表于当年的Nature 上［55］。此后不同研究小组将其他许多细胞如肺成纤维细胞、骨髓间质细胞、血液B 淋巴细胞等重编程后都得到了iPS。2012 年，徐清波等在重编程人皮肤细胞时更是将iPS 的获取时间缩短为4 d［56］。

由于iPS 细胞巨大的潜在应用价值，研究者们纷纷看好，并在短时间内已经取得了一系列突破。如Margariti 等从iPS 培育出了血管细胞，并注入肢体缺血的模型实验鼠中，形成了新的血管［56］。Lippmann 等将人iPS 和神经细胞、内皮细胞共培养于人工基底膜包被的培养板上诱导分化出了跨内皮电阻达(1 450 ±140)Ω·cm2的血脑屏障内皮细胞［57］。Nishimura 等将神经细胞重编程的iPS 移植到小鼠耳内，并成功发育成耳蜗毛细胞［58］。美国Herron 教授利用iPS 构建了大量的类似于大多数人的静息心率心肌细胞［59］。Duan 等将牙釉基质衍生物和iPS 共同接种到牙周质缺损处，发现新生的牙周膜连接牙槽骨和牙骨质［60］。Bilousova 等将用成骨诱导液培养的iPS 接种到明胶海绵支架上，并置于动物体内形成了功能性的成骨细胞［61］。Xu 等发现用胶原酶处理的iPS 经EB 分化模式可以容易地在接枝明胶的支架上诱导出成纤维样细胞［62］。

此外，iPS 还可以分化出大量的其他功能性细胞如造血细胞、神经胶质细胞、骨骼肌细胞等多种组织特异性细胞，这些研究成果充分证明iPS 可以作为组织工程研究中较为理想的种子细胞来源之一。但是iPS 也存在着自身的问题:研究还不够全面;长期生物安全性有待综合评价;细胞来源不统一，与宿主的相容性尚待确定等。

4 问题与展望

大量的实验研究证实干细胞在一定的诱导条件下可以分化为多种组织细胞，并且能够修复损伤组织或促进器官再生。因此，干细胞作为组织工程的种子细胞有望从根本上解决器官移植中的诸多问题，从而治疗临床上的多种疑难杂症。然而想要干细胞真正应用于临床实践还有许多困难需要克服:ESC 面临着法律、伦理和道德问题，体外培养要求严格，向特定细胞分化机制不明，容易在体内致瘤;MSC 治疗适应症、诊疗时机选择和作用机制不明朗;iPS 研究不够深入，生物安全性尚且不明。但是我们相信随着各种干细胞和生长因子应用等技术的成熟，这些问题的解决将指日可待。

我们课题组以铁系化合物为催化剂合成了一系列聚乳酸基可生物降解的低毒聚合物-以聚羟基乙酸PGA、聚L-乳酸、聚己内酯以及它们的共聚物为基材对其进行表面接枝改性，并运用热致相分离、电纺丝、自制模具等技术，获得了几种具有良好生物相容性的食道组织工程三维支架［63-65］，目前正应用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，进行深入的研究和探索，期待解决临床上病变食管修复或再生的难题，从而最终实现实验室生产食管组织器官的梦想，造福于人类。

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