恩替卡韦治疗后乙型肝炎病毒多聚酶区耐药基因检测分析

郭晓凤，张超贤，刘 雁，吴 菲，骆 欣

1杭州市西溪医院感染科，杭州 310023 2新乡医学院附属第一医院消化内科，河南卫辉 453100

恩替卡韦治疗后乙型肝炎病毒多聚酶区耐药基因检测分析

郭晓凤1，张超贤2，刘 雁1，吴 菲1，骆 欣1

1杭州市西溪医院感染科，杭州 3100232新乡医学院附属第一医院消化内科，河南卫辉 453100

目的研究恩替卡韦治疗后乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶区基因变异情况。方法收集恩替卡韦治疗后出现HBV病毒学突破患者的血清，采用聚合酶链反应(PCR)产物直接测序，分析HBV-P区基因变异发生情况。结果29例患者中检出恩替卡韦基因型耐药19例，其中16例(84.2%，16/19)既往有拉米夫定治疗失败史；17例(58.6%，17/29)变异类型以rtL180+rtM204+rtT184为主；7例(24.1%，7/29)为B基因型，22例(75.9%，22/29)为C基因型。7例B基因型中检出恩替卡韦基因型耐药者4例(57.1%)，22例C基因型中检出恩替卡韦基因型耐药者15例(68.2%)，差异无统计学意义(P=0.665)。结论恩替卡韦基因型耐药多出现于拉米夫定治疗失败后序贯治疗，rtL180+rtM204+rtT184变异类型在B和C基因型的恩替卡韦耐药中较为常见。

乙型肝炎病毒；耐药基因；基因型；恩替卡韦

ActaAcadMedSin，2013,35(4)：444-446

在慢性乙型肝炎的治疗中，抗病毒治疗是关键。恩替卡韦更是由于其抗病毒活性强且耐药发生率低，在我国2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中提出，如条件允许，开始治疗时宜选用恩替卡韦[1]。但随着恩替卡韦的广泛应用，尤其在拉米夫定等其他核苷类似物耐药的情况下序贯应用，一些患者经恩替卡韦治疗后出现病毒学突破导致治疗失败。本研究对此类患者进行了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)多聚酶区耐药基因检测和分析，以期为今后的临床治疗提供参考。

对象和方法

对象2008年1月至2011年12月在杭州市第六医院就诊并规范服用恩替卡韦(初治0.5 mg/d，拉米夫定治疗失败患者改换恩替卡韦1.0 mg/d)至少1年，出现病毒学突破的浙江籍慢性乙型肝炎患者29例，其中，男25例，女4例，平均年龄(36.7±10.4)岁(20～50岁)；所有病例诊断均符合2005年中华医学会肝病学分会及感染病学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准[2]，均自愿提供详细病史资料并接受抗病毒耐药检测。排除重叠感染、其他特异病因引起的慢性肝病、肝癌、肝硬化。病毒学突破及基因型耐药等定义参照指南。

检测方法及结果判定采用聚合酶链反应扩增HBV逆转录酶(reverse transcription，RT)区，由全自动测序仪(安玛西亚公司MegBACE500测序仪)对PCR产物直接测序[3]检测HBV-RT区常见的9个(169、173、180、181、184、202、204、236、250)耐药位点的变异情况。结果判定：rtM204I/V为拉米夫定、替比夫定耐药变异(LAM-R)，rtA181V、N236T为阿德福韦酯耐药变异(ADV-R)，rtL180M、rtV173L为rtM204的补偿耐药变异，rtA181T/S可见于拉米夫定治疗后HBV耐药变异，rtI169T、rtT184A/C/F/G/I/L/M/S、rtS202C/G/I、rtM250I/L/V为恩替卡韦耐药变异(ETV-R)。多位点变异(coexist-R)即LAM-R或ETV-R合并ADV-R。如果发现rtM204I/V及其补偿变异rtL180M/rtV173L合并rt(184、169、202、250)位点中的任意一种变异即认定为恩替卡韦基因型耐药。HBV基因型分型采用Taqman荧光PCR技术[4]，引物、探针及Taqman荧光PCR相关材料购于杭州博赛基因诊断技术有限公司。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，率的比较采用Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床资料及基因型分布29例患者中，7例(24.1%)为B基因型，22例(75.9%)为C基因型。B基因型和C基因型患者治疗前的谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)水平[(226±103)U/L比(251±91)U/L，P=0.549]、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis Be antigen，HBeAg)阳性率[71.4%比77.3%，P=1.000]、血清HBV DNA水平[(7.07±1.32)log10 copies/ml比(7.36±1.44)log10 copies/ml，P=0.627]差异均无统计学意义。

核苷类似物用药情况及HBVRT区变异位点检测结果29例患者，9例检出LAM-R；1例检出ADV-R；19例检出ETV-R，其中，恩替卡韦初治3例(15.8%)，序贯恩替卡韦治疗16例(84.2%)；未检测到多位点耐药变异。

HBVRT区变异类型、出现频率及比例29例患者中，rtL180+rtM204+rtT184变异17例(58.7%)，其中M204I 1例，M204V 16例；rtL180+rtM204V+rtS202变异2例(6.9%)；rtL180+rtM204V变异5例(17.2%)；rtM204I变异3例(10.3%)；rtN236变异1例(3.4%)；rtA181T变异1例(3.4%)。核苷类似物序贯治疗后HBV RT区变异类型较分散，rtM204单位点变异均为rtM204I；rtM204位点伴随其他位点变异的24例中，仅1例为rtM204I(4.2%)，23例为rtM204V(95.8%)。

HBV基因型与ETV-R检出率比较7例B基因型中检出恩替卡韦基因型耐药4例(57.1%)，22例C基因型中检出恩替卡韦基因型耐药15例(68.2%)，差异无统计学意义(P=0.665)。

讨 论

HBV发生耐药变异是核苷类似物长期抗HBV治疗的最大障碍，伴随耐药变异发生的是病毒学突破、生物化学突破、组织学恶化、肝功能障碍和肝炎相关并发症发生率的增加。恩替卡韦因其高耐药基因屏障受到临床医生的青睐，但对拉米夫定治疗后出现病毒学突破的患者序贯用恩替卡韦将导致恩替卡韦耐药率明显上升[5]。本研究中有19例患者检出恩替卡韦基因型耐药，其中恩替卡韦初治者3例；拉米夫定治疗后出现HBV病毒学突破，序贯恩替卡韦治疗者16例，该结果提示恩替卡韦基因型耐药多出现在拉米夫定治疗后，序贯应用恩替卡韦的患者中。恩替卡韦耐药基因屏障的打破有赖于rtL180M+rtM204I/V的存在[6]，即拉米夫定耐药位点(rt204)和伴随变异位点(rt180)的变异再加上任意1个恩替卡韦耐药位点rt(184、202、250)变异才能构成临床意义上的恩替卡韦耐药。本研究检测到的19例恩替卡韦基因型耐药中，变异类型以rt204+rt180+rt184为主，占83.5%。rtM204单位点变异均为rtM204I，rtM204位点伴随其他位点变异中以rtM204V变异为主，占95.3%。

治疗前血清HBV DNA载量、ALT水平、HBeAg状态可以预测核苷酸类似物的耐药发生率[7]。为此，本研究对入组的B基因型、C感染者治疗前血清HBV DNA载量、ALT水平、HBeAg状态做了比较，结果显示差异均无统计学意义，提示两组基因型在病毒耐药变异等方面的比较排除了其他主要因素的干扰。

HBV基因型是病毒变异进化的结果，根据HBV核苷酸序列的差异，可将其分为A～I共9种基因型，其分布具有地域性差异，我国以B型和C型为主，北方地区HBV感染以C基因型为主，南方地区以B基因型为主[8]。本研究对象来自南方地区，但29例患者中，HBV基因型构成比以C基因型为主(75.4%)，而不是B基因型(24.1%)，分析原因可能与本研究对象为恩替卡韦治疗后出现病毒学突破的慢性乙型肝炎患者相关。Liu等[9]在对中国1803例核苷类似物相关耐药变异的观察中发现，治疗后出现病毒学突破的患者中，C基因型占84.2%，B基因型占15.0%。谭朝霞等[10]的研究结果显示，核苷类似物治疗后C基因型感染较B基因型感染易出现病毒学突破。C基因型病毒复制水平高于B基因型，而高复制HBV易发生病毒变异[11]，恩替卡韦治疗后C基因型感染是否比B基因型感染易出现病毒学突破尚需进一步观察研究。本组7例B基因型患者中检出恩替卡韦基因型耐药者4例，22例C基因型中检出恩替卡韦基因型耐药者15例，差异无统计学意义。推测可能是由于样本量太少，故基因型与恩替卡韦基因型耐药的关系尚需扩大样本量进一步观察分析。

总之，恩替卡韦耐药多由拉米夫定治疗后出现病毒学突破序贯应用引起，恩替卡韦的初始治疗才能体现其高耐药基因屏障的优势。HBV基因型与恩替卡韦治疗后HBV病毒学突破及恩替卡韦基因型耐药检出率的关系须扩大样本量进行进一步观察分析。

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Drug-resistantGenesatHepatitisBVirusPolymeraseRegionduringEntecavirTreatment

GUO Xiao-feng1，ZHANG Chao-xian2，LIU Yan1，WU Fei1，LUO Xin1

1Department of Infectious Diseases，Hangzhou Xixi Hospital，Hangzhou 310023，China2Department of Gastroenterology，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Weihui，Henan 453100，China

GUO Xiao-feng Tel：0571- 86481526，E-mail：guoxf137@163.com

ObjectiveTo investigate the drug-resistant genes at hepatitis B virus(HBV)polymerase region during entecavir(ETV)treatment.MethodsSerum samples from chronic hepatitis B patients with virologic breakthrough during enticavir therapy were studied.The resistant mutation patterns in the polymerase gene of hepatitis B virus were analyzed using the polymerase chain reaction(PCR)-sequencing method.ResultsETV resistance was detected from 19 out of 29 ETV-refractory patients，among whom 16(84.2%)had a hisotry of lamivudine-refractory.The mutation patterns were diverse，while rtL180+rtM204+rtT184(58.6%，17/29)was most common in patients with ETV genotype resistance.Four of 7 patients(7/29，24.1%)with genotype B were detected to have ETV genotype resistance，while 15 of 22 patients(22/29，75.9%)with genotype C were detected to have ETV genotype resistance.The rate of ETV genotype resistance was 57.1%(4/7)and 68.2%(15/22)in patients with genotype B and genotype C，while no statistical difference was found(P=0.665).ConclusionsETV genotype resistance is more common in patients who have been refractory to ETV and lamivudine sequential treatment.rtM204+rtL180+rtT184 mutation is common in genotype B and C ETV resistance patients.

hepatitis B virus；drug-resistant genes；genotype；entecavir

郭晓凤 电话：0571- 86481526，电子邮件：guoxf137@163.com

R512.6+2

A

1000- 503X(2013)04- 0444- 03

2012-05-21)

杭州市医药卫生科技计划项目(2010A016)Supported by the Medical Fund of Hangzhou(2010A016)

10.3881/j.issn.1000- 503X.2013.04.016