陈 琰 刘桂锋 吴 玫 张桂珍 (吉林大学第二医院,吉林 长春 30042)
据国际糖尿病联盟(IDF)统计,目前全球糖尿病患者约3.66亿,估计2030年将增至5.52亿,在全球范围内呈上升趋势,其中2型糖尿病(T2DM)占95%以上〔1〕。T2DM是一种多因素引起的疾病,是由遗传易感性和环境因素复杂的相互作用而导致的,遗传因素在发病中起着非常重要的作用〔2〕。近年来随着全基因组关联研究(GWAS)结果的相继报道和单核苷酸多态性(SNP)分析技术的发展,至今已发现上百个常见基因变异与T2DM密切相关,但糖尿病的病因及发病机制尚不能完全阐明。因此,利用高通量、高效率、低成本、操作简便的SNP分析技术发现糖尿病易感基因并对其深入研究,为T2DM的早期预测以及寻找新的临床治疗靶标具有十分重要的意义。
通过对DNA序列的直接测序可以直接了解其内部的SNP位点的多态性和与疾病的关系。其检测效率可以达到100%。各种SNP分析技术检测得到的结果最后都是由测序确定其突变类型和位置。对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP检测可直接测序,但是由于测序检测 SNP的方法相对昂贵,所以不适用于临床大样本检测。
该技术系指将大量探针分子固定于支持物上,与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样品分子的数量和序列信息。该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上,一次性检测成百上千的DNA分子。Liang等〔3〕利用基因芯片技术对24例妊娠糖尿病和24例正常妊娠对照者rs13266634,rs266729,rs3802177和 rs9300039的 SNP位点进行检测,并以DNA测序方法进行验证,结果显示在妊娠糖尿病与正常妊娠者 SNP基因型的 rs3802177,rs13266634和rs266729显著差异,确定了用于筛选妊娠糖尿病的候选基因。2007年以来有关T2DM易感基因的GWAS也是利用了基因芯片技术〔2〕。这种技术由于芯片制作复杂,信号检测需专门设备,需要昂贵的费用,但在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选以及序列分析等领域已呈现出广泛的应用前景。
在部分变性的温度条件下,通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异,检测目的DNA变异。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同,在部分变性条件下,异源双链因有错配区的存在而更易变性,在色谱柱中的保留时间短于同源双链,故先被洗脱下来,在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。Liu等〔4〕在中国甘肃东乡族人群中采用聚合酶链反应-变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)检测出固醇调节元件蛋白1c(SREBP-1c)基因的 rs2297508和 rs11868035 SNP可能与T2DM相关,C等位基因可能是T2DM的危险等位基因。Liu等〔5〕将DHPLC和测序的方法相结合,对115例健康受试者和107例T2DM患者视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因两个单核苷酸多态性rs17484721和rs36035572进行检测,发现RBP4基因与T2DM有关。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。但由于不同类型纯合子的滞留时间几乎相同,因此不能检测出纯合突变。
原理是针对突变位点设计引物,扩增出含有突变位点的DNA片段,然后在PCR扩增产物中加入SNP序列特异延伸引物,在位点上延伸一个或若干个碱基,然后将制备的样品分析物与芯片基质形成结晶,将该晶体放入质谱仪中,当用激光激发晶体时,发生一个能量转移与解吸附过程,产生单电荷离子,在加速电场中获得相同的动能,在真空小管中飞行到检测器,利用质谱分析对质量的灵敏度特别高,很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开的特点,使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸区的反应产物,推导出SNP。MALDITOF-MS在SNP检测中具有很大的灵活性,高度的准确性,与多重PCR结合在大量样本的高通量检测中得到较广的应用〔6〕。Florez等〔7〕利用此方法验证了斯堪的纳维亚人蛋白质酪氨酸磷酸酶N1(PTPN1)基因多态性与T2DM的关系。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5'末端,而淬灭剂则在3'末端。PCR扩增时一对引物与特异性的荧光探针同时加入,探针完整的情况下,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,报告荧光基团与淬灭荧光基团分离,使得荧光监测系统接收到荧光信号,每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的同步。如果探针与目标序列中存在着错配碱基,就会减少探针与目标序列结合的紧密程度以及酶切的活性,影响释放荧光的强度,通过检测反应液中的荧光强度就可以确定SNPs分型。Semiz等〔8〕利用TaqMan探针技术对波斯尼亚和黑塞哥维那人的63例T2DM和79例正常对照者的N-乙酰转移酶2基因(NAT2)进行检测,发现NAT2基因变异与T2DM有关。Taq-Man探针技术在PCR过程中无需分离和洗脱,减少了PCR污染的可能性,操作简便、快捷,较适合少量位点大量样本的分型项目。但因所设计的探针仅有一个碱基的差异,所以检测结果存在一定的假阳性率。
在Taq DNA连接酶的作用下,当SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补,并且两条探针之间没有空隙时,连接酶通过催化磷酸二酯键将相邻的两根探针连接,从而发生反应,否则反应将不能进行,根据探针的设计,不同的基因型会产生不同长度的产物,最后通过荧光扫描片段长度,实现对 SNPs位点的检测。Shi等〔9〕在对中国人 177例T2DM和245例健康对照者的TRB3基因Q84R位点多态性研究中,应用PCR/LDR检测发现TRB3基因Q84R位点多态性与中国人T2DM的发生无关,但与中国人糖尿病和非糖尿病人群的空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗相关。优点:灵敏度高,特异性强,结果峰图直观,相对成本比TaqMan技术低。缺点:高通量应用中探针合成成本过高。
QDs作为生物荧光探针,有其独特的优越性:水溶性且稳定、荧光强、分辨率高,与DNA等生物大分子进行耦联,而且在同一激发光源下可以进行多色标记便于进行高通量的生物检测。有课题组〔10〕将解耦联蛋白3基因与脂联素基因的突变质粒与未突变质粒等体积混合,模拟基因组DNA,在同一体系内进行双重等位基因特异性PCR反应,并利用磁性纳米颗粒纯化PCR产物,再将PCR产物与红绿双色量子点标记的寡核苷酸探针进行杂交反应,通过荧光信号的检测,实现了同一体系内两种基因 SNP的检测。Li等〔11〕用585 nm和650 nm发光CdTe QDS通过链霉亲和素与生物素分别结合不同的DNA寡核苷酸序列,并与毛细管电泳法(CE)结合,成功同步检测两种基因的单碱基突变。QDS荧光探针技术可以同时检测多个单碱基突变,是一种高灵敏度的、很有前途的SNP分析技术。
2006年以前,T2DM的遗传学研究比较缓慢,从2007年开始,有关欧洲、亚洲、美洲等人群的T2DM易感基因多态性的GWAS结果的报道,使人们对T2DM遗传学有了突破性的认识。截至目前T2DM GWAS已达二十多项〔12〕。研究发现联合大多数的遗传变异仅能解释不到10%的T2DM遗传可能性〔13〕。Vioght等〔14〕研究也显示已知的T2DM基因变异仅能解释10%~15%的家系相对危险度。这些变异体占T2DM总遗传力的比例很小。可能是由于GWAS仅检测到了等位基因频率>5%的变异,而现有的检测方法难以检测高效应值、中效应值低频率、罕见的变异。在过去的十余年里,许多不同的基因分型技术被用于检测T2DM易感基因SNP和其他常见的多态性变异。最新一代的SNP检测方法是基于纳米材料技术、各种荧光标记和荧光探针、多重PCR等技术的结合和利用,以便于提高SNP检测的精准性和通量。随着技术的进步,SNP检测方法不断推陈出新,如何应用高通量、低成本的技术来检测T2DM易感基因的罕见变异,将成为开发新的预防和治疗方法以及个性化医学的基础。
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