头颈部恶性肿瘤前哨淋巴结的研究进展

刘 弦(综述) ，黄桂林(审校)

(遵义医学院附属口腔医院 口腔颌面外科，贵州 遵义 563099)

头颈部恶性肿瘤前哨淋巴结的研究进展

刘 弦(综述) ，黄桂林(审校)

(遵义医学院附属口腔医院 口腔颌面外科，贵州 遵义 563099)

头颈部恶性肿瘤;前哨淋巴结；前哨淋巴结活检术

头颈部恶性肿瘤是世界上第五大最常见的恶性肿瘤，全球每年约有逾50万新发生的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinomas，HNSCC)病例，其5年生存率不到55%[1]。头颈部恶性肿瘤治疗的重点在于肿瘤原发灶和淋巴结区域性转移的控制，准确地了解颈部淋巴结区域转移有利于肿瘤分期和治疗以及对预后的判断。前哨淋巴结能准确反映整个淋巴结群的状态，这一活检技术的开展为研究及治疗头颈部恶性肿瘤淋巴结转移提供了一种新方法。现就其定位方法、临床检测进行综述。

1 定位方法

前哨淋巴结活检(sentinel lymph node biopsy, SLNB)技术的关键在于SLN的示踪定位。目前用于SLNB定位的方法主要有三种: 生物染料标记法、放射性核素示踪法和CT间接淋巴造影法(CT lymphography, CT-LG)。其中，为提高SLN的检出率，常采用核素和染料的联合定位。

1.1 生物染料标记法 生物染料标记法通过在肿瘤周围注射有色染料试剂，观察淋巴结染色情况来检测前哨淋巴结。最接近肿瘤的蓝染淋巴结或位于蓝染淋巴管末端尚未染色的淋巴结均为SLN，其原理是前哨淋巴结的抗原提呈细胞(dentric cell)可吞噬肿瘤区域的染料而使之浓集[2]。因此，也称蓝染料法，常用的染料有1%的异硫蓝(isosulfan blue)、75%的专利蓝(patent blue)和1%的亚甲蓝(methylthionnium)。其中前两种在国外较常用，而国内较常使用亚甲蓝。在没有核医学设施和经验的中心，建议单独采用蓝染料作为示踪剂。用蓝染料作为示踪剂可使医患双方免于接触放射性核素，医疗成本低，无原发灶散射线对发现前哨淋巴结的干扰作用甲蓝比异硫蓝便宜得多，且不引起超敏反应和其他严重的并发症(除了皮肤坏死，但在手术中如果小心注射能避免)[3-4]。更重要的是它在术中的淋巴结示踪效果与异硫蓝一样好[5]。由此可见，在以蓝染料作为示踪剂性行前哨淋巴结活检术时选择亚甲蓝是一个理想的举措。但有时易失败，且染色时间较短，要求术者熟悉解剖，操作仔细。

1.2 放射性核素示踪法 放射性核素示踪法包括术前淋巴闪烁显像法(lymphoscintigraphy, LSG)和术中γ-探针探测法(a gamma ray detecting probe, GDP)。术前2h将示踪剂注射于肿瘤周围组织, 然后进行淋巴闪烁照相术,大致确定SLN的位置,并于皮肤上进行标记[6]。术中手持γ-探测器进行探测,发现放射性明显高于周围组织的淋巴结即被认为是SLN。其灵敏性达93%，无颈淋巴结转移的预测价值为91%～100%[7]。因能够快速从注射部位进入淋巴管、在淋巴结内停留时间较长、对机体放射性伤害小、半衰期短、配制工艺简单等优点，99Tcm胶体被广泛应用于SLN的定位。其中最常用的放射性示踪剂为99Tcm硫胶体，其检出率可达到96%～99%[8-9]。也有学者开始研究使用硫化铼胶体替代。Jimenez等[10]测量的硫化铼胶体颗粒大小在8～68nm。Ruano等[11]使用硫化铼行乳腺癌前哨淋巴结活检，检出率达99%。术中γ-探针探测法是放射性核素示踪法的关键。随着科技的进步，高灵敏的手提探测仪及ECT显像等为我们探索头颈部的SLN提供了有利的工具。一些学者对头颈癌，特别是头颈鳞癌进行了成功的探索。Ross[12]等研究发现在48例cN0头颈部鳞状上皮细胞癌中单用LSG和LSG+GDP，SLN的检出率分别为81%和95%。放射性核素法与经典的解剖指导法相比，其优势在于它扫描了功能解剖区而不仅仅是解剖结构区。

1.3 CT间接淋巴造影法 操作原理是利用淋巴微管壁薄而多孔的特点，在局部注射的造影剂经由淋巴引流到达淋巴系统后，通过CT显影，再根据淋巴结和淋巴管显影的相互关系或淋巴结CT值的改变定位SLN。Hayashi等[13]以CT-LG法准确定位了浅表食管癌患者的SLN，以及邻近原发灶的SLN和远距离超越一个区域的SLN，认为这些远距离的淋巴结可能以前被认为是跳跃性转移。

1.4 核素染料联合定位 操作方法是先通过在肿瘤内或肿瘤周围黏膜下注入生物染料和放射性示踪剂，进行SPECT显像扫描，探头检测到“热点”后在皮肤标记；然后，术中寻找染色节点和“热”结点。有文献[14-15]报道称国内染料法平均SLN 检出率为89.8%，核素法检出率为92.7%，将两者联合应用能够使SLN 检出率进一步提高至94.6%，并可以使假阴性率从10.0%降低到8.2%。对于肥胖患者而言，行小切口深部SLN 活检术较为困难，此时联合核素示踪方法比单纯使用蓝染料更有利于寻找深部的SLN，同时，降低了操作者的熟练程度和细致程度对结果准确性和手术疗效的影响。

2 检测技术

示踪剂定位SLN的部位后，临床上还需对淋巴结良恶性作出诊断，进而辅助判断是否行淋巴结清扫术。

2.1 组织病理学技术 SLN的常规组织病理学检测方法是苏木精-伊红(HE)染色，阳性率为89%[16]，但易遗漏微小转移灶。文献[17]报道，直径为0.5mm的微转移灶被检出可能性只有11%，若直径为0.2mm的微转移灶检出的可能性仅为4%。

染色连续切片(SSS-HE)染色法在常规切片的基础上增加切片次数，能够大大提高淋巴结微转移的检出率。张建利等[18]发现此法可以快速判断头颈部鳞状细胞癌淋巴结微转移的效果及微转移对肿瘤预后的影响。但是，连续切片费时费力，不适用于大量的淋巴结微转移的检出，也不宜在临床上常规推广应用。

2.2 免疫组织化学技术 Barrera等[19]对头颈部鳞癌淋巴结标本进行常规病理组织学检查及免疫组化检查，其发现的隐匿性转移率分别为3.8%、29%，免疫组化检查的特异性及敏感性较高。有文献[20]报道，在传统SSS的基础上进行改进，将所取的淋巴结沿着淋巴结门垂直平分成两半后进行甲醛固定、石蜡包埋。对石蜡块以4μm层厚150μm层距进行SSS，对所得的切片编号，第1、11、16号切片进行HE染色，第2、12、17号切片进行免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测，避免用一个中心层面代替了整个淋巴结，缩小工作量，提高了隐匿性转移的检出率。但是要对所有切除的淋巴结进行连续切片和免疫组化法等精确检查是不切实际的。

2.3 分子生物学检测技术 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)是目前灵敏度最高的微转移检测技术，其通过特异性扩增肿瘤细胞中含有而背景细胞中不表达的mRNA，检测的灵敏度可达1/107～1/108[21]。细胞角蛋白(cytokeratin，CKs)是细胞骨架系统中间丝的组成成分之一，广泛存在于上皮组织细胞中，而在间叶组织(如血液骨髓淋巴结等)中缺乏表达，其中CK19几乎可在所有上皮细胞及其起源的上皮类肿瘤中检出，而正常外周血及淋巴结中无CK19的转录，因此己成为上皮性肿瘤细胞较为敏感和特异的肿瘤转移标志物。如CK19检测淋巴结微转移对头颈部鳞癌的预后具有预测价值[21]。由于CK是上皮组织的特异性标志，理论上在淋巴结、血液及骨髓等检材中不存在其mRNA反转录，采用PCR扩增出的CK mRNA即能证明存在上皮源性肿瘤细胞[22-23]。然而RT-PCR技术极高的灵敏度，使得细微的干扰都会被联级放大而产生假阳性结果。

分子生物学检测技术还包括荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)和基因芯片技术。FISH技术主要用于染色体异常的检测。在头颈癌中更多的是用于肿瘤细胞的生物学特性研究，确定肿瘤发生和转移相关分子标记物，如癌基因异常表达，定位及预后的评价[24]。PCR技术是一种灵敏度和特异度极高的DNA体外扩增技术，能在数小时内将所要研究的目的基因或DNA片段扩增106～108倍[25]。该技术的出现很大程度上促进了对微转移的检测。但此技术的缺点在于PCR扩增的同时可能改变样本中DNA的突变率，以及分析的灵敏度。基因芯片技术具有快速、高效、高通量分析生物信息的特点，只用一次杂交反应就能在全基因组范围内同时分析待测样本中成千上万个基因表达情况，从而弥补常规方法的不足[26]。已有多项研究[27-28]结果表明基因芯片技术有助于开发有关头颈部鳞状细胞癌转移的预测分子标记和治疗靶点。该技术的缺点在于芯片价格昂贵，样本制备及反应条件难以掌握导致出现较高的假阴性及假阳性，数据及图像分析时间较长。因此，此技术需进一步提高芯片的特异性，降低成本，提高数据及图像的处理速度，才能有效应用于临床。

除此之外，纳米材料研究的新进展，有人用硒化镉制成量子点及标记有荧光团的聚合物对肿瘤细胞及淋巴管进行标记，为肿瘤细胞的迁徙及转移，以及淋巴管引流的路径进行观察并确定前哨淋巴结的位置[29]。这将使得前哨淋巴结的检查更加精确，并最终用于临床研究。

3 SLNB在头颈部恶性肿瘤中的应用

SLNB用于头颈部恶性肿瘤中是由于它能够使患者避免花费更多时间以及承受更高患病率风险，降低患者进行不必要颈清的概率，并且能够以最低危险及最小伤害性的伤口观测到淋巴结状态。此外，应当进行术后“严密观察”，其能够检测到在淋巴引流模式外涉及到病变的潜在结节，还能对拒绝颈淋巴清扫术的患者提供选择。

颈部存在多个位置及多变的前哨淋巴结是行SLNB另一个问题，再加上手术过程中光透效果(主要瘤体光照造成颈部结构模糊)对手术过程中适当评价前哨淋巴结都会造成一定程度的困难。此外，选择性颈清扫术的低发病率也会降低避免这类问题所产生的技术性需求的利用。在美国，由于上述原因大多数的医生仍然选择舌骨肌上清扫术，而不是前哨淋巴结活检。通过一个决策分析模型对选择性颈淋巴清扫术和前哨淋巴结活检术的性能比较，结果表明选择性颈淋巴结清扫术可以更好的发现微转移率，发现率在 20%～40%[30]。因此，在现阶段，前哨淋巴结活检术仍然不能作为医疗标准。

4 展望

随着当今医学的飞速发展和人们对疾病认识水平的不断提高，在保证疗效的基础上尽可能地提高患者生存质量成为当今发展趋势。头颈部恶性肿瘤手术治疗也不断向功能保留和微创发展，根据肿瘤淋巴引流部位的区域性淋巴结清扫术得到广泛应用。SLN的定位术及术中活检在这方面已取得了初步的成功，但仍有一些问题需要进一步研究：头颈部淋巴系统丰富，淋巴结交通支众多，若癌栓栓塞淋巴导管或引起淋巴引流改变，会导致示踪剂不能至SLN，而且核素扫描对设备要求高；头颈部肿瘤易发生跳跃式转移及双侧转移；另外，邱蔚六[31]指出SLNB虽然手术入路较小，但对头颈部恶性肿瘤手术而言仍然有损伤到周围神经的可能，尤其是面神经和副神经。由于头颈部恶性肿瘤手术破坏了淋巴引流，此技术很难应用于术后淋巴结转移复发的判断。目前头颈部恶性肿瘤的SLNB的研究样本群都较小，缺乏大样本多中心的研究，且没有长时间随访的结果，所以对远期疗效的影响尚不能肯定。

近年来国内和国外都已经利用免疫组化双标记技术，将P504s和P63、34(E12这3种抗体调制成鸡尾酒抗体，用不同的颜色在同一张切片上同时显示前列腺癌细胞和基底细胞，其步骤简单，节约成本，有利于病变的观察及研究。这一技术已被证实可提高穿刺活检中小灶性前列腺癌和前列腺上皮内肿瘤(PIN)的检出率。[32]然而这种穿刺活检结合双重免疫组化染色技术在头颈部恶性肿瘤SLBN中的应用尚属空白，具有很大研究价值。

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[收稿2012-09-02;修回2013-03-04]

(编辑：王福军)

R739.91

A

1000-2715(2013)02-0180-04

黄桂林，男，博士，教授，硕士生导师,研究方向：头颈部肿瘤，E-mail:chaojiehuanghgl@163.com。