兔VX2口腔鳞状细胞癌模型的研究进展＊

张 林(综述)，黄桂林(审校)

(遵义医学院附属口腔医院口腔颌面外科，贵州遵义 563099)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是危害人类健康的常见恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的5%。口腔鳞癌中34%为舌癌、30%为口底癌、颊粘膜癌与牙龈癌各为16%和11%［1］，常伴有区域淋巴结转移，晚期可发生远处转移。因此，建立用于研究的口腔鳞癌动物模型是十分必要的。常用实验动物有裸鼠、小鼠、大鼠和兔;方法包括化学药物诱导法、移植瘤法、转基因法等。其中利用VX2肿瘤细胞制作的兔口腔鳞状细胞癌模型具有操作简单易行、可重复性好、瘤体存活率高和建模时间短等优点。且其侵袭、血道、淋巴管转移方式与人类口腔颌面部癌相似［2］。因此，它对人类口腔癌的研究具有十分重要的意义，是现在常用的口腔癌动物研究模型。

1 VX2肿瘤的来源及历史

1933年Shope和Hurst［3］发现了在家兔皮肤上自然发生的由病毒引起的乳头状瘤，将该病毒命名为Shope乳头状瘤病毒，并且通过这些乳头状瘤恶变，可形成鳞状细胞癌。1936年 Kidd［4］将 Shope病毒的提取物接种到划破的兔皮肤斑点上，约10个月后成功诱发了鳞癌。随后Kidd在1936年以“V1”命名第一代该肿瘤细胞并报道移植成功，但是V1肿瘤在二次传代中停止生长。V1肿瘤在实验过程中，还导致了“V2”鳞癌细胞系的出现。最初V2鳞癌细胞接种在荷兰条纹兔上只有5%的成瘤率。第三代“V2”细胞成瘤率提高到21%。关于移植成功的报道一直持续到第十四代，V2鳞癌细胞可快速在接种动物的体内生长。在传代接种的过程中，V2细胞越来越向未分化的方向发展，其恶性程度不断提高，不仅可在兔类成瘤，还可接种于小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等动物。最后经72次传代后鳞癌细胞性质稳定，在1940年统一命名为“VX2”细胞株。1952年Kidd等报道新西兰种属兔缺乏针对VX2鳞癌细胞的抗体，并确定为稳定的可移植细胞株。

2 VX2鳞癌细胞的培养及特征

无菌操作下摘取荷瘤兔VX2肿瘤边缘增殖活跃的部分瘤体，按一般动物细胞培养方法［5］，可用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液对肿瘤组织进行原代培养。苏畅等［6］通过对VX2细胞进行离体培养，用最初纯化的细胞在相差显微镜下观察，可见到扇形的细胞质，经一段时间传代后细胞呈单层贴壁生长的上皮样细胞排列，生长成团后即出现重叠生长现象，细胞以长三角形、多边形为主。HE染色见VX2细胞为轻度嗜碱性，核大且核质比例异常，细胞异型性明显，核分裂象多见。刘险峰等［7］取第55、56代细胞培养后测定其生长特性，发现用1.5×105个/瓶细胞浓度进行接种，到第3天达到高峰。VX2细胞的分裂指数为8.49%，细胞倍增时间为34.5 h。流式细胞仪进行细胞周期分析，结果为:G1期占69.3%，G2 期占5.6%，S 期占25.1%。

3 VX2肿瘤细胞的冻存与复苏

为防止反复接种导致的肿瘤污染和避免肿瘤恶性程度降低，可对VX2细胞或瘤块进行冻存。将100 mL/L胎牛血清和80 g/L的二甲基亚砜加入RPMI1640培养液中配制成冻存液，取对数生长期细胞和冻存液混匀后放入液氮罐中保存。冻存细胞复苏后置于细胞培养箱中培养，VX2细胞成活率可大于 80%［8］。

从瘤兔身上取出的VX2瘤块经过清洗、剪碎及离心后，按沉淀物体积1∶1加入冻存保护剂(体积百分比为二甲亚砜:胎牛血清:RPMI1640培养液=20∶8∶72)［9］，通过梯度降温可冻存于液氮中。采用该方法冷冻6个月复苏后的瘤块与新鲜瘤块接种制作荷瘤兔的成瘤率和生长方式无明显差异［10］。

4 荷瘤兔的制作方法

VX2肿瘤细胞可通过植入一个1～3 mm3大小瘤块或者1mL培养的细胞悬液(107～109个/mL)到兔的后腿外侧肌肉、腹部、腹股沟区及颈后皮下等处制成荷瘤兔［11］。瘤块与细胞悬液相比，致瘤率和肿瘤生长速度都有提高［12］。瘤块植入后腿肌肉内的成瘤率较高，可达90% ～100%［13］。

瘤块制作荷瘤兔方法如下:在无菌操作下取出VX2瘤兔肿瘤，清洗后把鱼肉样新鲜组织浸泡在4℃生理盐水或者RPMI1640培养液中，用手术刀片和剪刀将瘤块剪切成1～3 mm3大小瘤块备用。兔麻醉后取俯卧位，后腿外侧除毛备皮，固定四肢，常规术区消毒铺巾，扪及后腿外侧肌肉丰富区，作一长约1cm左右切口，切开皮肤、皮下及筋膜组织，钝性分离肌肉形成一深约0.5～1 cm的小腔隙，并需有血流出，用眼科镊夹持2～3个瘤块植入，棉球压迫止血后分层缝合创口。术后可予普鲁卡因青霉素22 000 U/kg连续抗炎治疗3 d。2周左右可在兔后腿肌肉接种区扪及一直径约1～2 cm的实性肿块，即荷瘤兔制作成功。接种后3～4周瘤体直径可达2～4 cm，此时肿瘤细胞生长旺盛且坏死组织少，最适宜取出肿瘤进行细胞传代培养或用瘤块制作下一批荷瘤兔［14］。随着时间推移，瘤体越长越大，4周后其表面皮肤可出现破溃，切开瘤体见内部有明显的液化坏死，荷瘤兔的生存时间一般为6周左右。

5 兔口腔内不同部位的鳞癌模型制作及研究

VX2肿瘤常用于建立兔颊部和舌部的口腔鳞癌动物模型。颊部鳞癌模型的制作方法分为2种，即口外接种法和口内接种法。口外接种法是兔麻醉后取俯卧位，固定后在兔口外面颊部行常规术区备皮消毒后，于咬肌区作一5～10 mm大小切口切开皮肤，分离皮肤、皮下组织和筋膜，直至显露颊肌，取3～4粒备用瘤块植入颊肌内，并使肌肉内有少量出血，用棉球压迫止血后分层缝合。口内接种法是将兔取仰卧位，固定四肢，用绷带牵拉上下颌前牙，使兔大开口，在口腔内颊黏膜咬颌线上下常规术区消毒后，作一长约3～5 mm的纵行切口，分离显露颊肌，将3～4粒备用瘤块植入到颊肌中，同样植入时使肌肉少量出血，创口局部止血后严密缝合以保证瘤块不会溢出。2～3周后，接种瘤块的兔颊部均可扪及直径约1～3 cm大小的瘤体，表明兔颊部VX2鳞癌模型成功建立。

童树友等［15］采用口外法和口内法制作颊癌模型对比，口外法15只兔成瘤率为100%，口内法15只兔因颊部瘤体向口内突出，容易因摩擦导致破溃和出血，并影响动物进食和呼吸，有4只兔死亡。VX2肿瘤植入后的第2周，瘤兔一般状况可，第3～5周出现精神萎靡、食欲减退、体重减轻、毛色暗淡、轻度腹泻等症状，并呈进行性加重，在6周左右瘤兔全部死亡。Li－Min Lin［16］等在8只新西兰大白兔左颊部植入VX2瘤块，6周后发现肿瘤破溃外露，没有发现有远处脏器转移，但是其中4只兔子一共有11个颈淋巴结转移，平均每只兔有2.75个转移淋巴结，还有1只兔的下颌骨被肿瘤组织侵犯。朱坤鸥等［17］采用激光和5－Fu缓释剂联合对兔颊部VX2鳞癌的作用研究，证实用药前3周静脉推注5－Fu组比颊部植入5－Fu缓释剂对肿瘤体积的抑制效果强，但第3周后缓释剂组对肿瘤的抑制要明显大于静脉给药组，而5－Fu缓释剂在激光的配合下对肿瘤的抑制作用更加明显，其他各组与联合治疗组比较有显著差异。

兔舌部的鳞癌模型可根据舌的不同部位进行制作，方法类似于口内颊部肿瘤模型的建立，是切开兔舌部黏膜后植入1～2个瘤块，缝合创口，术后1周即可观察到舌部溃烂和瘤体形成。Jefferis AF等［18］第一次报道成功制作了兔舌部VX2鳞癌模型，其生物学和病理学上是最为接近人舌癌的大型动物模型。沈毅等［19］将舌分为舌前1/3舌缘、舌前1/3中线、舌中1/3舌缘和舌中1/3中线4区分别建立舌癌模型，并观察其颈部淋巴结转移情况，发现成瘤兔最早第3周可发现有颈淋巴结转移，总转移率达70%，而4个分区的舌癌导致颈淋巴结转移差异情况无统计学意义，兔的生存期为4～6周。Seki S等［20］通过抗血管生成剂TNP－470对舌癌瘤兔进行耳缘静脉给药，发现该药可明显抑制肿瘤生长和淋巴结转移，TNP－470处理组毛细淋巴管的平均数量显着少于对照组，收集的淋巴管平均直径明显小于对照组。

6 展望

兔VX2鳞癌的生长、转移和侵袭等生物学行为依赖于移植的位置，和人类自然发生的口腔癌有一定的区别，且其在传代过程中个别肿瘤可能会出现自发性衰退，导致成瘤率随传代次数增多而下降。但是VX2鳞癌细胞制作的兔口腔癌模型，其肿瘤生长、淋巴结和远处转移方式均和人类口腔癌相似［21］，比小型动物模型有易于操作、成瘤率高和动物生存期较长等明显优势，是目前最理想的大型口腔癌动物模型［22］。现在国内外对兔VX2口腔癌模型的基础和临床研究相对较少，未来可对VX2鳞癌细胞的成瘤原理、转移机制、免疫逃逸现象以及各种临床治疗方法等行进一步探索，特别是临床上最佳化疗方案的选择、对头颈部转移癌的放化疗结合治疗以及在口腔肿瘤治疗中应用新抗癌缓释药物的系列研究，将为口腔癌治疗方法的相关理论提供有力的支持依据。

［1］Robert Jelle Johan van Es.The Rabbit VX2 Auricle Carcinoma:An Animal Model for Development of New Locoregional Treatment Strategies Against Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck［J］.Proefschrift Universiteit Utrecht，2001，27(2):13 －14.

［2］van Es R J，Franssen O，Dullens H F，et al.The VX2 carcinoma in the rabbit auricle as an experimental model for intraarterial embolization of head and neck squamous cell carcinoma with dextran microspheres［J］.Lab Anim，1999，33:175 －184.

［3］Shope R E，Hurst E W.Infectious papillomatosis of rabbits:with a note on the histopathology［J］.J Exp Med，1933，58(5):607 －624.

［4］Kidd J G，Rous P.Cancer deriving from virus papillomas of wild rabbits under natural conditions［J］.J Exp Med，1940，71(4):469，494.

［5］Dunne A A，Schmidt A，Kuropkat C，et al.The auricular VX2 Carcinoma－－an animal model for sentinel node concept［J］.In Vivo，2003，17:457 － 461.

［6］苏畅，张惠中，李文海，等.兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性［J］.第四军医大学学报，2006，27(9):844－847.

［7］刘险峰，任乐荣，苏广彦，等.兔VX2肿瘤细胞系的建立及其生物学特性的观察［J］.中华病理学杂志，2005，34(10):661－663.

［8］Voelkel E F，Tashjian A H Jr，Franklin R，et al.Hypercalcemia and tumor－prostaglandins:TheVX2 carcinoma model in the rabbit［J］.Metabolism，1975，24(8):973 －986.

［9］Egli R J，Sckel A，Fraitzl C R，et al.Cryopreservation with dimethyl sulfoxide sustains partially the biological function of osteochondral tissue［J］.Bone，2003，33(3):352 －361.

［10］屈三甫，刘红芬，郑从义，等.VX2鳞癌组织的超低温长期保存［J］.肿瘤防治研究，2005，23(3):183.

［11］Prat F，Centarti M，Sibille A，et al.Extracorporeal high －intensity ultrasound for VX2 liver tumors in the rabbit［J］.Hepatology，1995，21∶832 －836.

［12］梁明辉，王晓东，夏力丁，等.兔后肢和肝脏接种VX2肿瘤方法的研究［J］.哈尔滨医科大学学报，2011，45(4):323－326.

［13］胡培安，周正荣，张国福.兔肢体VX2软组织肿瘤MR扩散加权成像［J］.放射学实践，2012，27(3):337 －341.

［14］张洪新，刘燕，曾伟，等.兔肝VX2移植癌模型建立方法的比较［J］.中华肝脏病杂志，2002，10(2):149.

［15］童树友，张娟，朱坤鹍，等.兔口腔VX2肿瘤模型的建立［J］.安徽医科大学学报，2008，43(2):151 －153.

［16］Li－ Min Lin，Yuk － Kwan Chen，Chi－ Hsien Chen，et al.VX2－induced rabbit buccal carcinoma:A potential cancer model for human buccal mucosa squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncology，2009，45(11):196 －203.

［17］朱坤鸥，王世亮，陈殿良，等.激光和5－Fu缓释剂联合作用对兔颊部VX2肿瘤的抑制和PCNA的表达［J］.安徽医科大学学报，2008，43(2):154 －156.

［18］Jefferis A F，Berenbaum M C.The rabbit VX2 tumor as a model for carcinomas of the tongue and larynx［J］.Acta Otolaryngol，1989，108(122):152 －60.

［19］沈毅，孙坚，周晓健，等.兔舌不同部位VX2鳞癌与颈淋巴结转移模型的生物学特性［J］.上海口腔医学，2007，16(5):497 －501.

［20］Seki S，Fujimura A.Three － dimensional changes in lymphatic architecture around VX2 tongue cancer－－dynamic changes after administration of antiangiogenic agent［J］.Lymphology，2003，36(4):199 － 208.

［21］Dunne A A，Plehn S，Schulz S，et al.Lymph node topography of the head and neck in New Zealand White rabbits［J］.Lab Anim，2003，37:37 －43.

［22］Chen Y K，Lin L M.DMBA －induced hamster buccal pouch carcinoma and VX2－induced rabbit cancer as a model for human oral carcinogenesis［J］.Expert Review of Anticancer Therapy，2010，10(9):1485 －1496.