HATs与HDACs在肺癌上皮细胞间质转化中作用机制及其应用的研究进展

常锐 尤嘉琮 综述 周清华 审校

组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases, HATs）是一类参与基因表达调控的重要蛋白质家族，其催化底物蛋白质的乙酰化修饰过程。组蛋白和非组蛋白都可作为HATs的底物，其中组蛋白的乙酰化有利于打开致密的核小体结构，活化基因转录的起始。与此相反，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetyltransferases, HDACs）催化相反过程，从而使靶基因沉默。在细胞中，HATs和HDACs调控组蛋白的乙酰化水平，使得靶基因的水平保持在动态平衡中。可乙酰化的非组蛋白包括转录因子、细胞骨架和信号通路蛋白等，它们乙酰化后的功能也是多样的，如转录激活、亚细胞定位、微管调控和细胞周期调控等。这些HATs的底物蛋白共同组成了体内的乙酰化蛋白网络，对于细胞正常的生长发育、维持内环境稳态十分重要。某些重要信号途径中的HATs或HDACs产生突变，将很可能导致疾病发生乃至癌变。

上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮细胞在外界刺激或病理条件下，细胞之间的连接弱化并失去极性，进而具有间质细胞特征形态的过程。因此EMT在肿瘤上皮细胞转化为间质细胞的过程中发挥功能，参与肿瘤的侵润与迁徙。研究发现，细胞内某些转录因子参与调控EMT过程，包括Snail、Slug、Twist、ZEB1/2等蛋白。Snail、Slug和ZEB通过直接抑制E-cadherin启动子活性来促进EMT过程，Twist等其它因子则间接抑制E-cadherin转录，说明这些转录因子在EMT的调控中行使重要功能。

近年来，有关HATs和HDACs家族蛋白参与肺癌EMT过程的报道逐渐增多。一类关注于p300、PCAF等HATs与EMT转录因子的相互作用及其对间质化过程的影响。某些EMT转录因子和HATs具有蛋白质相互作用，甚至作为底物被乙酰化修饰，初步阐明了HATs家族蛋白参与肿瘤EMT过程的调控机制。另一类则研究HDACs参与肺癌EMT的作用机理，包括肺癌组织中HDACs表达的相关性研究，以及HDACs与EMT转录因子相互作用抑制E-cadherin表达水平的机制等。还有报道通过HDACs的抑制剂（HDAC inhibitor, HDACi）处理细胞，发现多种肺癌细胞中的HDACs被抑制后，E-cadherin表达上调，EMT转录因子被抑制，进而使EMT过程受阻，表明这一类药物具有影响EMT和临床治疗的潜在应用价值。据此，本文分别从HATs、HDACs参与肺癌EMT的作用机制，以及HDACi在肺癌治疗中的潜在应用等方面进行论述，以期探讨HATs和HDACs调控肺癌EMT的分子机制和应用前景。

1 HATs参与肺癌EMT的作用机制

1.1 p300与肺癌EMT及其转录因子 近年来，关于HATs家族蛋白尤其是p300和EMT关联性的研究逐渐增多[1,2]。作为细胞内重要的HATs之一，p300参与多种肿瘤发生与进展过程，其突变或失调导致多种疾病，许多癌基因的表达也受到p300调控。

关于肺癌中p300参与EMT的分子作用机制，目前已有初步了解。台湾一个研究小组[3]的结果表明，肺癌迁徙中Runx2的水平上调有利于募集p300并促进Snail转录，进一步实验发现其机制是Runx2通过募集p300增强组蛋白乙酰化，继而使Snail表达上调，说明p300可能在Snail诱导的EMT中发挥重要功能。还有研究[4]基于p300和I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体（serine/threonine kinase receptors I, TβR I）在细胞核中共定位的结果，发现p300和TβR I相互作用并激活Snail转录，促进肿瘤细胞的侵袭。此外，另一EMT转录因子Twist也证实与p300有相互作用，而且Twist与p300的HAT结构域直接结合，干扰其乙酰化组蛋白，体外乙酰化实验亦证明这一结果。在肿瘤细胞中Twist可能通过抑制p300对组蛋白的乙酰化修饰，促进上皮细胞的间质化过程[5]。Postigo等[6]发现ZEB1可能募集p300并促进转录激活，使得ZEB1活性升高，从而有利于EMT过程。生物信息学分析显示E-cadherin启动子含有潜在的p300结合位点，Liu等[7]通过染色质免疫共沉淀实验，得到的研究结果确证了这一设想。即在p300与E-cadherin启动子结合的模型中，p300可能募集其它转录因子，共同促进E-cadherin的表达水平。

1.2 PCAF与肺癌EMT及其转录因子 p300/CBP结合蛋白相关因子（p300/CBP-bingding protein-associated factor,PCAF）是另一种在人类和其它真核生物中保守存在的组蛋白乙酰转移酶，同样具有乙酰化组蛋白的活性，行使转录辅激活因子功能。Shiota等[8]对PCAF和Twist的相互作用进行研究，发现PCAF可乙酰化Twist，其底物Lys分别位于第73、76和77位。乙酰化促进Twist进入细胞核并促进其转录水平，进而细胞的侵袭能力增强，有利于EMT的发生。如将Twist的乙酰化Lys突变，使其无法被PCAF乙酰化，则阻碍Twist进入细胞核，说明Twist的乙酰化修饰对其发挥促EMT功能是重要的。如敲除PCAF，同样观察到肿瘤生长和侵袭受抑制。Hamamori的小组[5]证实了Twist同样抑制PCAF乙酰化组蛋白，这种现象基于Twist的N端和PCAF的HAT结构域/溴区之间的相互作用，因为N端缺失的Twist不能抑制PCAF的乙酰化功能。还有证据表明PCAF参与ZEB1调控miR-200水平的模型：一般情况下，ZEB1抑制miR-200c/141转录，而PCAF和p300可与ZEB1在miR-200c/141启动子处组装成复合物，同时PCAF乙酰化ZEB1，使ZEB1由抑制物转变为激活因子，促进miR-200c/141转录上调。这些结果说明ZEB1的活性是受乙酰化调节的，暗示在肿瘤细胞中EMT转录因子功能受翻译后修饰调控可能具有一定普遍意义[9]。

1.3 其它HATs与EMT及其转录因子 CBP与p300在结构和功能上有较高的同源性，在体内促进CREB介导的转录。在果蝇的胚胎发育中，发现果蝇CBP可结合于Twist启动子并激活Twist表达，与此相反，CBP突变体无法正常诱导Twist表达，进而影响果蝇的胚胎发育[10]。Hlubek等[11]通过酵母双杂交实验证实，组蛋白乙酰转移酶Tip60与ZEB蛋白有相互作用，它们可能形成复合物，共同起阻遏作用。如将Tip60敲除，可使组蛋白乙酰化减弱，并增强细胞对顺铂的敏感性[12]。虽然这些结果与肺癌细胞EMT并非直接关联，但对于在肺癌中开展类似研究具有一定参考价值。

2 HDACs参与肺癌EMT的作用机制

随着对HATs在肺癌EMT中作用机制的深入研究，关于HDACs与肺癌EMT关系的研究也为人们所关注。Han等[13]通过免疫组化和RT-PCR对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）组织中的HDAC1和HDAC2的表达水平进行研究，发现与正常肺组织相比，NSCLC组织中HDAC1和HDAC2的表达具有更高的相关性，与分化程度和TNM分期也有一定关联。这一结果表明对于肺癌细胞的生长和分化，HDACs同样发挥重要作用。

有关HDACs在肺癌及肿瘤EMT中的作用机制，以E-cadherin表达受HDACs抑制的分子机理研究较为清楚。Peinado等[14]发现Snail与HDAC1和HDAC2有相互作用，而且Snail可募集它们结合E-cadherin启动子，组成抑制复合物，从而使组蛋白H3和H4去乙酰化，抑制E-cadherin的转录起始，最终有利于EMT过程。与此同时，有研究小组同样观察到HDAC1的过表达导致E-cadherin启动子的活性减弱，转染HDAC1的shRNA可有效抑制肿瘤细胞的转移，进一步证实了HDAC1与侵袭性有关[15]。Tang等[16]的研究发现高热量饮食导致的E-cadherin降解和EMT过程中，HDAC表达水平也呈现上升趋势，暗示其在间质化过程中具有一定普遍性。Snail自身的转录也受HDAC1抑制，但p68的磷酸化使HDAC1从Snail启动子上解离，Snail水平随即上调，E-cadherin表达受阻而导致EMT发生[17]。此外，一项在肺癌细胞HCC95中的研究[18]表明，细胞中HDACs的水平上升可能源于miR-449a/b的调节，从另一角度说明肺癌细胞中HDACs的调控可能是一个多层次、复杂的过程。

综上所述，HDACs在肺癌与肿瘤EMT中，其表达水平与正常组织有差异。从分子机制来看，它可与EMT转录因子相互作用并直接影响靶基因表达水平，以达到沉默上皮细胞基因的目的，导致间质化过程的发生。HDACs也可能通过其它途径影响肺癌细胞的生长分化。因此，HDACs具有作为抑制肺癌EMT与临床治疗靶点的潜在意义，其应用前景值得深入探讨。

3 HDACi在肺癌治疗中具有潜在应用价值

如前文所述，HDACs在抑制肺癌E-cadherin表达水平和促进EMT过程中具有关键作用。据此，将其作为治疗靶点，用药物处理以期干扰HDACs行使功能，不失为阻止肺癌细胞EMT和细胞迁徙、转移，并应用于肺癌治疗的有效途径。目前，已有HDAC抑制剂应用于肺癌细胞，促进E-cadherin表达回复的报道，为进一步将其研发为药物奠定了基础。Kakihana等[19]用多种HDACi处理NSCLC细胞系并检测细胞中EMT标志物的表达水平，他们的结果表明MS-275上调E-cadherin的效果最为明显，且诱导细胞凋亡和抑制NSCLC细胞生长。另一项对长期吸烟影响EMT的研究[20]中，研究者发现MS-275抑制烟草浓缩物处理的A549细胞的迁徙与侵润，E-cadherin也有所上调。Mateen等[21]用TSA与silibinin处理H1299细胞，观察到细胞中E-cadherin水平明显回复，肿瘤细胞的侵润和迁徙能力也得到明显抑制。与此同时，ZEB1的表达亦受影响而下调，说明TSA与silibinin具有协同抑制肺癌细胞EMT的作用。

鉴于HDACi本身具有促进组蛋白或底物蛋白乙酰化的功能，所以此类药物在实际应用中，也可能经由这一途径实现抑制肺癌细胞的效应。Singh等[22]用Magnolia grandiflora中提取的honokiol处理A549、H460等NSCLC细胞，发现它具有抑制HDAC活性的功能并促进组蛋白乙酰化，继而NSCLC的细胞活性明显降低。通过口服honokiol，接种于裸鼠皮下的A549和H1299细胞生长也受到明显抑制。在NSCLC中silibinin可通过抑制HDAC上调组蛋白H3和H4的乙酰化水平，与TSA共处理则导致G2/M阻滞和细胞凋亡，并抑制异种移植肿瘤的生长，表明HDACi与silibinin联用应该是一种安全有效的治疗NSCLC生长的用药方式[23]。

另一方面，用HDACi与其它药物共处理肺癌细胞，被认为可进一步发挥两种药物的协同抑制作用，因而是HDACi应用于肺癌治疗的又一有效途径。在一篇最新报道中，研究人员用一种新的HDACi-PTACH与17-DMAG（分子伴侣Hsp90的抑制剂）共同处理A549、H460和H1299细胞，获得了比单药物处理更好的对肿瘤细胞迁徙的抑制效果[24]。Zhang等[25]观察到在培养的A549细胞中，经TSA与化疗药物docetaxel或erlotinib共处理，可上调α-tubulin的乙酰化水平、诱导细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的增殖，因此他们认为HDACi与化疗药物联用具有协同抑制肺癌细胞的功能。鉴于DNA甲基化在肿瘤转移中的重要功能，将VPA和decitabine（一种DNA甲基转移酶抑制剂）共处理U1906和H2171细胞，发现caspase-8在mRNA和蛋白水平均上调，并使得这些小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand, TせIL）治疗变得敏感，因而具有潜在临床价值[26]。

综合这些结果，可知HDACi具有抑制肺癌细胞EMT的功能。它也可通过促进组蛋白乙酰化，以及与其它药物共同使用来影响多种肺癌细胞的生长，所以在肺癌临床治疗中具有较好的潜在应用前景。如对HDACi与其它药物联用的领域继续深入研究，将使肺癌的治疗更加游刃有余。

4 问题与展望

肺癌作为危害我国人民健康与生命的重大疾病之一，长期以来都是研究的热点领域。转移是导致肺癌难以治愈和死亡的重要因素，它是一个复杂、多层次和多阶段的病理过程，涉及抑癌基因突变、肿瘤相关蛋白表达水平改变、信号通路的活化等方面。其中，EMT过程是肺癌转移的重要步骤，参与此过程的转录因子（如Snail和Twist）在调控此过程中起到关键作用。从功能上，已知EMT转录因子抑制E-cadherin等蛋白的表达水平，但其在肺癌中的详细作用机制尚不清楚。HATs和HDACs作为基因表达水平的重要调节因子，控制着机体内环境的动态平衡。近年的研究发现它们同样参与上皮细胞的间质化进程，可与某些EMT转录因子相互作用并使其乙酰化。而且，这一研究方向在其它类型的癌症中同样有所报道[27-31]，说明此领域有可能成为阐明EMT和肿瘤转移分子机制的新突破点。鉴于HDACs具有促进EMT的功能，使用TSA等HDACi抑制其表达水平，已被诸多研究[7,29,32]证实可有效抑制多种肿瘤细胞的EMT过程。与其它药物联用以强化对肿瘤细胞的抑制作用，是HDACi应用于肺癌治疗的新兴领域。因此，筛选具有较好抑制效果、副作用少的HDACs抑制剂，利于为研发治疗肺癌或其它癌症转移的药物开拓新的方向。综上所述，对HATs和HDACs在肺癌细胞EMT中作用机制的研究，有助于丰富肺癌转移的分子生物学基础研究，而HDACi对于EMT过程的有效抑制，更预示着其在肺癌临床治疗中具有重要的潜在应用价值。