骨髓间充质干细胞的特性及应用基础研究进展

连真珍 综述 林绍强 审校

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞，又称骨髓基质干细胞或间充质祖细胞[1]。BMSC不仅具有高度可塑性和强大的分化潜能，而且具有易获得、易培养、低免疫原性和避免伦理问题等特性。在治疗免疫性疾病、皮肤再生、心血管疾病、急性肺损伤、骨损伤和血液系统疾病等方面取得了一定成果[2]。也有报道指出，BMSC存在致瘤性及安全性等问题[3]。BMSC真正广泛用于临床治疗仍需进一步深入研究。本文就BMSC的特性和临床治疗应用基础研究进展作一综述。

一、BMSC的分离、培养和扩增

骨髓中存在大量的间充质干细胞，是BMSC的主要来源。分离方法、培养面积、培养基、接种浓度、各种生长因子、供者年龄和疾病状态等均可影响BMSC的增殖、分化和免疫学特性。目前在体外分离培养方法主要有：（1）贴壁法，也称全骨髓法或一步法，根据BMSC具有黏附贴壁生长的特性进行分离；（2）密度梯度离心法，根据各种骨髓细胞比重不同获取单个核细胞进行贴壁培养。密度梯度离心法被认为是最经典的方法,目前常用的有Percoll或Ficoll分离法；（3）利用表面标记分离纯化细胞方法，根据间充质干细胞表面标记分选。主要有流式细胞仪分离法和免疫磁珠分选法。流式细胞仪分离法利用相应的荧光素标记抗体进行筛选。磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，从而使细胞得以分离。由于BMSC特殊的生物学特性以及其含量很低，而且抗原表面不特异，分离纯化较为困难[4]。因此，有待进一步研究一种简便、高效和经济的分离和纯化方法。

二、BMSC的特性

1.形态和生长特征：体外培养的BMSC体积小，核仁明显，核浆比较大，培养时贴壁，可聚集成均匀的集落。在体外获取的BMSC为形态和增殖特性有差异性的异质性细胞群，至少有两种类型的细胞：纺锤状的细胞和扁平或立方形的细胞。BMSC在原代及第一代骨髓贴壁细胞培养中，包含形态多样的细胞群，其中大多数为造血性干细胞。经传代培养，造血性干细胞逐渐死亡，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95﹪和98﹪。体外分离的原代 BMSC 接种后 0～4 d 贴壁生长，但增殖不活跃，为潜伏期；大约 0～4 d 细胞生长极为活跃，呈指数级递增，为对数增长期；10d后生长逐渐减慢，为平台期；细胞生长曲线呈“S”型。

2.表面标志物：间充质干细胞的分化可能是随机非方向性的，已经分化的间充质干细胞依旧具有转化生成其他类型间充质细胞的潜能，而且个体不同发育阶段的间充质干细胞的表型功能特异方面存在差异。迄今为止对于间充质干细胞鉴定没有特异的分子标记，这方面有待进一步深入研究。目前广泛认为，间充质干细胞表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124、CD166 和多种表面蛋白。一般认为，BMSC重要标志表达CD29、CD44，CD166，CD105等，但不表达 CD34、CD38、白细胞表面抗原CD45、CD11a和CD14等造血干细胞表面标志[5]。目前主要通过其形态特征、表面标记及其具有向骨、脂肪、软骨等多种方向的分化潜能这多方面相结合来进行鉴定[6]。

3.低免疫原性：BMSC低表达组织相容性复体Ⅱ类抗原，不表达Fas配体和诸如CD40，CD80和CD86等共刺激分子，使其免疫原性降低[7]。BMSC不仅可以逃避免疫系统的识别，而且还可以主动抑制宿主免疫系统。Krampera等[8]研究表明BMSC可以抑制T细胞增殖而达到抑制T细胞介导的免疫反应。Nauta等[9]则认为BMSC能够诱导机体记忆性T细胞激活并针对移植物发生免疫排斥，减少移植物的存活时间，因此，BMSC可能不是完全免疫豁免。

三、BMSC的多向分化潜能

研究表明BMSC具有多向分化潜能，但不能自发分化。在体外特定的诱导条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、星形胶质细胞等多种中胚层来源的细胞，它还可以跨胚层分化为神经细胞和胰岛细胞等[10]。但是诱导分化出的细胞在体内是否能有效地归巢到特定部位，并有效地发挥生理功能尚待更多的证据进一步研究。在体外诱导分化的研究中，成骨细胞是报道最多的一种，在体内、体外实验中均得到肯定。可诱导成骨的因子有地塞米松、维生素C、IL-11、IL-6、透明质酸、胰岛素样生长因子结合蛋白及其他因子，如BMP、bFGF等。诱导得到的成骨细胞可通过检测纤维粘连蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶等来鉴定。研究证明，BMSC能分化为神经元和胶质细胞，在脑组织受伤后特别明显[11]。Woodbury等[12]用β-硫基乙醇、硫代甘油、叔丁基对甲氧酚等诱导人和大鼠来源的BMSC分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。Perez-Ilzarbe等[13]报道bFGF培养BMSC表现出明显的刺激增殖作用，而且在低浓度下具有诱导其向神经元样细胞分化的作用。地塞米松、胰岛素、吲哚美辛和泌乳素等能诱导BMSC分化为脂肪细胞，在细胞内逐渐聚集含脂质丰富的小泡，可以用油红0染色鉴定。在培养基中加入特定因子体外培养，BMSC可向有功能的肝细胞分化[14]。BMSC能够分化为胰岛素分泌样细胞，还能改善局部微环境，促进残余胰岛细胞增殖和自体干细胞归巢到病灶的作用[15]。Chen等[16]将传代的BMSC置入含烟碱、β-巯基乙醇培养，可见成簇分布的胰岛样细胞。有报道BMSC还能分化为表皮角质细胞、皮脂腺细胞和皮脂腺[17]。大量研究显示BMSC可以被5-Aza诱导为心肌样细胞[18]。Yan等[19]运用p53抑制剂PFT-a阻断p53-p21信号转导通路后，观察到BMSC向心肌细胞分化，PFT-a可提高BMSC向心肌细胞的转化率。Orlic等[20]将Lin(-)C-kit(+)的原始骨髓干细胞移植到大鼠心肌梗死局部，发现移植细胞也可以分化产生心肌细胞、内皮细胞等。BMSC诱导分化的细胞类型，分化能力及机制目前还在探索中，细胞分化是细胞在可逆性的轻度损伤和细胞外因素的诱导下，细胞通过诱导物与诱导细胞表面受体结合而调控细胞分化。因此，在诱导分化过程中，诱导组织的专一性和反应组织的反应能力必须在时空上相互配合，才能保证诱导细胞向特定细胞分化。

四、BMSC的应用基础研究现状

1.肝病的应用：BMSC易于外源基因的导入和表达，遗传背景稳定，培养过程中长期保持多细分化的潜能，是有效进行肝移植治疗肝硬化的新型种子细胞。在肝纤维化动物模型中证实，BMSC具有抗纤维化的作用[21]。Mohamadnejad等[22]治疗4例晚期肝硬化患者，体外培养BMSC，再经肘静脉注射回患者。结果表明，所有患者均无死亡、急性肾衰竭、肝脏失代偿加重、甲胎蛋白持续增高、肝脏出现肿块等并发症。Tomoya等[23]研究认为BMSC对CCl4诱导的慢性肝功能障碍引起的炎症纤维化病变有作用。Schmelzle等[24]分析数据表明，CD133+骨髓基质细胞对大部分肝切除产生积极的影响。

2.血液系统疾病的应用：Koç等[25]用体外培养扩增的自体BMSC联合HSCT治疗大剂量化疗后的乳腺癌患者28例,移植后造血恢复增快，提示BMSC可促进造血恢复。Lee等[26]治疗1例高危急性髓细胞白血病患者，采集并移植其父亲外周血造血干细胞联合体外扩增BMSC，患者无不良反应，提示BMSC可用于急性白血病的半相合造血干细胞移植。Le Blanc等[27]治疗7例血液系统疾病患者，将BMSC和造血干细胞共同移植，患者均健康。实验证明，BMSC可以促进骨髓移植后中性粒细胞和血小板快速恢复，造血干细胞联合BMSC移植，可以加快造血干细胞的植入，促进造血的恢复，防治急慢性移植物抗宿主病的发生[28]。

3.骨和软骨疾病的应用：近十年中BMSC被认为细胞替代疗法的理想种子，可能是因为BMSC旁分泌作用，可分泌多种因子使组织特异性细胞生长和分化，并且防止损伤细胞凋亡。Horwitz等[29]将BMSC静脉注射到成骨不全患者体内，术后6个月时患者的身高均增加。Wakitani等[30]治疗24例骨关节炎患者，给予BMSC并用胶原包被，25 d后即可见软组织覆盖，42周后缺损处有透明软骨样组织形成，提示用自体BMSC来修复关节软骨缺损是可行的。Quarto等[31]将自体BMSC局部注入治疗骨折中大面积的骨缺损获得成功。研究发现自体BMSC植入治疗早期股骨头坏死有一定的作用[32]。转基因的BMSC治疗狗股骨头缺血性坏死模型实验中，结果表明BMSC在治疗股骨头缺血性坏死中有良好的作用[33]。Cella等[34]将BMSC注射入患者骨坏死部位，患者接受手术后，结果显示2周后症改善，进行15个月后，基本愈合，30个月后，患者没有出现双膦酸盐-颚骨坏死迹象。随着越来越多的学者参与，BMSC的研究也会更加深入，在骨疾病的治疗也会有更广阔的应用前景。但目前对于BMSC治疗机制的研究还存在很多问题。

4.神经系统疾病的应用：越来越多的学者关注BMSC在神经退行性疾病治疗方面的研究，为各类神经损伤的细胞治疗提供新的可能。近两年，BMSC被视为理想的多巴胺的替代细胞来源，为治疗帕金森氏病提供可行性的方法[35]。BMSC移植在治疗大鼠胸椎脊髓损伤，移植后5周，移植大鼠明显好转，可负重步行等[36]。有研究显示BMSC对亨廷顿氏病（HD）大鼠模型有改善作用[37]。Otero等[38]在研究中，脑内注射同种异体BMSC于成年大鼠脑出血模型中，术后对内源性神经再生和移植BMSC的生存进行了研究。研究结果表明，异基因BMSC移植后，供体细胞能存活在脑组织表达神经元和星形胶质细胞标记。显而易见的，干细胞作为细胞替代治疗开辟了新的视角，大量的研究结果显示细胞治疗在神经疾病提供了巨大潜力。

5.心血管疾病的应用：心血管疾病在老年人群中具有是高度的死亡率和发病率，干细胞的发展为治疗缺心血管疾病提供新的治疗前景。Amado等[39]的研究结果表明BMSC疗法能够治疗猪的心脏病发作或者心肌梗塞。Tse等[40]将患者自体BMSC通过导管把细胞注入稳定型心绞痛患者心脏缺血区，3个月后患者的症状、缺血区心肌灌注以及心功能明显改善。Suzuki等[41]在猪慢性冬眠心肌模型中接受自体BMSC，结果表明接受干细胞可改善冬眠心肌的冠状动脉血流或减少瘢痕体积，增加心肌细胞的数量，并减少细胞肥大。将BMSC移植到受损心肌中，用免疫荧光显微镜观察发现超顺磁性氧化标记的移植细胞与心肌的心肌标志物的定位，表明受损的心肌再生[42]。

6.皮肤缺损创面修复的应用：研究证实，BMSC可以分化为表皮细胞、毛囊细胞等参与修复过程。Vojtas等[43]报道，在溃疡处注射体外扩增培养的BMSC，结果溃疡面积不断减小，血供良好，皮肤增厚。BMSC被移植到烧伤动物模型中，进行再生汗腺排汗试验和免疫组化分析鉴定，多项研究表明外异蛋白修饰的BMSC有修复和再生受伤的皮肤及其附属物的应用潜力[44]。研究人员发现在脲佐菌素诱导糖尿病啮齿类动物模型侧皮肤缺损模型中，给予BMSC治疗大鼠愈合时间明显缩短。免疫组织化学分析，在治疗组与对照组相比，表皮生长因子、血管内皮生长因子、脯氨酰4-羟化酶和Ki-67表达量显著增加，BMSC可通过组织再生加强皮肤愈合[45]。

7.免疫系统的应用：大量文献显示，BMSC对免疫的调节涉及多种免疫细胞及多种可溶性细胞因子，其相互作用交错复杂。BMSC可调节B淋巴细胞的增殖、移行、分化、抗体的生成和趋化作用。Corcione等[46]将BMSC和正常人外周血B淋巴细胞共同培养，发现当两者比例为1:1时，BMSC对B淋巴细胞增殖有抑制作用，B淋巴细胞的功能也受到了限制。学者用细胞小室试验证实，BMSC释放的可溶性细胞因子如IL-6和细胞黏附因子-1可显著抑制B淋巴细胞的增殖[47]。BMSC除了直接或间接发挥对T淋巴细胞的免疫调节作用外，研究表明BMSC能够通过上调调节性T细胞的比例从而诱导免疫耐受[48]。Ciccocioppo等[49]收集难治性或不适合目前可用的治疗方法的12例克隆氏病患者，给予BMSC治疗，结果诱导治疗无任何不良影响，黏膜中调节性T细胞的比例显着增加。除了直接影响淋巴细胞，BMSC还通过对树突状细胞调节实现对免疫细胞的间接调控。Spaggiari等[50]研究也表明，BMSC不仅能抑制NK细胞的增殖，而且能抑制对靶细胞的杀伤作用等效应功能。

五、小结

目前BMSC的研究和应用取得了很大的进展，证实由于强大的分化潜能及具有易于分离培养扩增、遗传背景稳定、体内植入反应较弱等特性，使其在组织工程种子来源、细胞代替治疗、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用。但是有关BMSC的许多生物学特性和分子调控机制尚不十分清楚，BMSC的安全性问题还不确定，诱导分化后细胞是否具有正常的结构和功能，移植细胞是否整合到相应的组织等诸多问题有待于人们进一步探索。有的学者认为成体干细胞的可塑性是由细胞融合所致，或在成体组织中可能有胚胎期残留下来的原始多能干细胞。迄今在BMSC的研究中虽然存在争议和问题，也显示出许多好的前景和征兆。人们将在不远的将来有效地解决这些问题，使BMSC更安全地用于临床，更好地造福人类。

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