部分抗结核分枝杆菌药物的耐药机理研究进展

丁海榕 秦川 占玲俊

·综 述 ·

部分抗结核分枝杆菌药物的耐药机理研究进展

丁海榕 秦川 占玲俊

结核病是危害严重的重大传染病之一，抗结核药物的应用在治疗结核病的过程中具有重要意义。然而抗结核药物治疗不当会引起耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌的出现，导致结核病抬头。结核的耐药多与耐药基因突变有关，笔者总结了常见抗结核药物的耐药分子机制的研究进展，为耐药结核的诊断和治疗提供分子依据。

抗结核药； 抗生素类，抗结核； 抗药性，细菌

结核病是全球严重的公共卫生问题，每年因结核病死亡患者达130万例。中国是全球5个结核病高负担地区之一。2010年15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万［1］。结核分枝杆菌是结核病的病原体，已与人类共同进化上万年［2］，为抗酸阳性棒状杆菌。抗结核药物的发现在治疗结核病的过程中具有里程碑的意义，然而结核分枝杆菌像其他病原微生物一样，在人类接受治疗过程中通过自然选择获得耐药，而耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌的出现使全球应对结核病的任务更加艰巨。

结核分枝杆菌因无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，所以染色体介导的耐药是结核分枝杆菌产生耐药的主要分子基础，除此之外，结核分枝杆菌细胞壁结构与组成的变化、自身的药物外排泵系统也参与了结核分枝杆菌的耐药形成。结核分枝杆菌耐药与染色体上耐药基因编码区和启动子区突变有关，目前某些抗结核药物的耐药分子机制已明确，新的机制也一直在研究中［3］。笔者着重总结结核分枝杆菌染色体介导的耐药机理研究进展，以下分别就抗结核药异烟肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇和氨基糖苷类，氟喹诺酮类和新大环内酯类的耐药机制研究进展进行介绍。

一、一线抗结核药物

异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素因其疗效好、不良反应小、患者较易耐受而归为一线抗结核药物。

（一）异烟肼

异烟肼对结核分枝杆菌具有极强的杀灭作用，其价格低廉，是治疗结核病必不可少的药物。结核分枝杆菌耐异烟肼涉及的基因变化：katG，inhA，kasA，ndh，sig I及oxyR-ahpC基因连接区。

1.katG基因：katG基因是结核分枝杆菌染色体中的一个功能区段，编码过氧化氢-过氧化物酶，结核分枝杆菌内的过氧化氢-过氧化物酶活化异烟肼，活化产物作用于enoyl-ACP还原酶（属于脂肪酸合成酶Ⅱ系统，能促进短链脂肪酸合成脂肪酸），抑制分枝菌酸和细胞壁生物合成。引起异烟肼耐药的主要原因是katG基因的点突变、缺失、插入。katG基因常见的点突变是315位AGC→ACC，还可见463位CGG→CTG、88位Gln→Arg和155位Tyr→Ser，此外还发现katG基因104、108、138、148位等突变［4-5］。有研究表明，异烟肼耐药的临床分离株中有44%～64%检测到315位AGC→ACC的氨基酸置换［6-7］，Rouse等［8］的研究表明，结核分枝杆菌中katG基因完全缺失可导致结核分枝杆菌对异烟肼高度耐药。Lee、Marttila等［4，9］发现katG基因463位CGG→CTG的突变不能作为结核分枝杆菌对异烟肼耐药重要的分子标记，也有研究认为463位是katG基因的重要功能区段，决定着产物酶的活性［10］。

2.inhA基因：inhA基因编码烯酰基乙酰载体蛋白（enoyl-ACP）还原酶inhA，此酶参与分枝菌酸的生物合成，而分枝菌酸是结核分枝杆菌细胞壁的重要组成成分。活化的异烟肼与酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）结合，形成高亲和力的共价化合物，是inhA酶的有效抑制物［11-13］，从而阻止了分枝菌酸的生物合成，进而发挥抗菌作用。inhA基因发生突变或基因的结构发生改变时，可导致结核分枝杆菌对异烟肼耐药。突变包括点突变，碱基或部分DNA链缺失。突变多出现在启动子区，少数突变出现在编码区（编码inh A，acp M，kasA），出现上述突变的临床分离株中表现为对异烟肼低水平耐药［14］。某些inhA结构基因发生突变时，表现为对异烟肼高度耐药，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为8 mg/ml［15］。Ano等［16］发现inhA的变异约48.9%发生在启动子-15区的C→T，约4.3%发生在-8区的T→A的点突变。当inhA启动子区的突变伴随katG基因突变时，细菌的耐药性明显增强［17］，而大部分的耐异烟肼的结核分枝杆菌的基因突变发生在katG和inhA这两个基因。inhA的突变不仅引起异烟肼耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟肼的耐药［18］。

3.kasA基因和ndh基因：kasA基因编码β-酮酰基载体蛋白合成酶，参与分枝菌酸生物合成，全长1251 bp，编码471个氨基酸，其中最常见的突变是第312位点。kasA基因突变在异烟肼耐药中作用机制并不明确，因为对异烟肼敏感的菌株同样有kasA的突变，而耐异烟肼的结核分枝杆菌中也发现有katG或inhA基因的突变［19-20］。ndh基因编码NADH脱氢酶，它的突变引起酶活性的缺失，从而导致NADH/NAD十比例升高，抑制异烟肼的过氧化，同时对异烟肼和乙硫异烟肼都耐药［21］，具体耐药机制还未见报道。

4.sig I基因：sigI是一个调节基因，结核分枝杆菌的基因组共编码13个sigma因子（绝大部分sigma因子参与调节毒力），sig I是其中一个，结核分枝杆菌利用这些sigma因子的调控以适应各种环境变化。

Nature Communications上最新研究表明：sig I在静止期和热休克期转录水平升高，sigI又直接作用katG启动子区从而调节katG的转录表达，因此sigI基因突变会抑制katG的转录从而引起异烟肼的耐药，而过度表达sig I会增加结核分枝杆菌对异烟肼的敏感性。一般地，耐药会引起细菌适应性的降低［22］，而sigI突变株并没有引起适应性的降低，毒力相比野生株增强，缺乏sigI的结核分枝杆菌毒力也并未减弱反而增强［23］。可见，异烟肼耐药不仅与常见耐药直接相关基因突变有关，还与调控耐药基因表达的调控基因突变有关。

5.oxyR-ahpC基因连接区：oxyR基因调节分枝杆菌氧化-应激反应，既是氧压感应器又是基因转录的活化剂，本质上是个假基因，与结核分枝杆菌对异烟肼敏感性无关，但oxyR控制编码解毒酶基因如katG和ahpC基因的表达。ahpC基因编码烷基-氢过氧化物还原酶，与细菌对氧化压力的反应有关，某些katG突变的耐异烟肼分离株ahpC启动子存在突变，ahpC表达增强来补偿触酶-过氧化物酶的表达缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。ahpC基因突变可作为katG基因突变的标志，但两者不是简单直接的因果关系［24-25］。

（二）利福平

利福平对结核分枝杆菌有很强的杀灭作用，是继异烟肼之后最为有效的抗结核药，也是初治肺结核治疗方案中不可缺少的组成药物。利福平作用于结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶，抑制mRNA的转录，发挥抑菌和杀菌作用。结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶有α/β/γ3个亚基，分别由rpoA，rpoB和rpoC编码。β亚基编码的氨基酸序列中507aa-534aa、567aa-574aa、687aa 3个区域突变与利福平耐药有关［26］。rpoB基因的突变又以81bp的利福平耐药决定区（由507-533位的27个氨基酸组成）突变为主，突变类型包括点突变、小的缺失和短的插入等，81 bp上最常见的突变（65%～86%）是引起526位氨基酸的碱基CAC突变为TAC和531位氨基酸的碱基TCG突变为TTG，并导致对利福平高水平的耐药（MIC＞32μg/ml），发生在511，516，518 和522位的突变导致对利福平和利福喷丁低水平耐药，但仍然对其他两种利福霉素：利福布丁和利福拉齐（rifalazil）敏感［27-28］。最新研究发现：某些利福平耐药株除了有rpoB突变外，还存在rpoA，rpoC的突变；少数耐利福平的菌株无rpoB基因突变，同时少数敏感株中检测到rpoB基因突变，说明结核分枝杆菌对利福平耐药还有一些机制未明确［29］。

（三）吡嗪酰胺

吡嗪酰胺对细胞内或静止状态下的结核分枝杆菌具有特殊杀灭作用。在酸性环境下吡嗪酰胺酶将吡嗪酰胺转化成具有活性的吡嗪酸而发挥杀菌作用。吡嗪酰胺酶失活导致吡嗪酰胺不能转化为吡嗪酸，从而引起结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药。吡嗪酰胺耐药多由于编码吡嗪酰胺酶的pncA基因发生突变所致［30］。pncA基因全长561 bp，突变主要发生在结构基因和启动子区。目前在二级结构上也已经明确吡嗪酰胺酶活性位点（D8、A134、C138）和金属结合位点（D49、H51、H71）对酶活性影响最大且基因突变发生率高［31-32］。突变以碱基置换为主，还可见插入突变（单个碱基变化如421插入C、47插入G，多个碱基变化如390插入GG、185插入CC、258插入GGAC）和缺失突变（如421缺C）［33］。

Cuevas-Córdoba等［34］首次报道从墨西哥收集的2007—2010年临床耐药株中，对吡嗪酰胺耐药的菌株中发现了D63A、F94S、K96R、V125F、A143P和T160K的突变，碱基的缺失引起氨基酸缺失和读码框的改变以及141位、375位核苷酸的插入突变。

大部分吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌含有pncA突变，但一部分耐药株却未发现此突变，Shi等［35］研究发现吡嗪酸的一个新的作用靶点：核糖体蛋白S1（RpsA），此蛋白参与结核分枝杆菌蛋白翻译和反式翻译过程中核糖体的释放，他们发现吡嗪酸与RpsA结合，抑制其与tmRNA结合，然后抑制反式翻译（反式翻译与压力生存、细菌毒力和营养缺乏的恢复相关，在细菌活动生长条件下是非必须的，但在压力环境下解除翻译过程中受阻滞的核糖体或损伤的mRNA和蛋白却很重要），因此RpsA过量表达能引起吡嗪酰胺耐药，但对其他药物如异烟肼、利福平、链霉素、卡那霉素和诺氟沙星没有影响。某些吡嗪酰胺耐药的临床分离株中并无pncA突变而存在RpsA蛋白结构的改变：编码RpsA的rpsA基因1314位GCC缺失导致RpsA的C末端丙氨酸的缺失，从而影响吡嗪酸与Rsp A结合，导致耐药的发生。

（四）乙胺丁醇

乙胺丁醇对结核分枝杆菌有抑制作用，特别是对已耐异烟肼、链霉素的结核分枝杆菌仍有抑制作用。乙胺丁醇是一种阿拉伯糖类似物，作用于结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，影响细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-蛋白聚糖复合物形成，发挥抗菌作用。阿拉伯糖基转移酶编码基因emb的操纵子突变导致耐药，该操纵子由embA、embB和embC三个基因组成，而embB基因（约3246 bp）突变改变了阿拉伯糖基转移酶结构，影响其与药物结合产生耐药，尤其是306位密码子的错位突变最为常见（约48.3%乙胺丁醇耐药株和32.5%乙胺丁醇敏感但对其他一线药耐药的菌株都有此突变，而泛敏感的菌株未检测到此突变，因此embB基因306位密码子的突变不能有效预测EMB耐药，特别是耐多药结核分枝杆菌菌株）［36］，其为Met→Val、Ile、Leu置换。还有285位Phe→Leu，330位Phe→Val和630位Thr→Ile置换［37］。

二、注射用抗结核药物

（一）链霉素

链霉素属于氨基糖苷类抗生素，是初治肺结核强化期（开始2个月）化疗方案组成药物之一，对结核分枝杆菌有明显杀菌作用。

研究认为大多数结核分枝杆菌耐链霉素是由于核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA编码基因rrs突变所致［38］，rpsL基因编码的核糖体蛋白S12除了自身与链霉素结合外，还介导链霉素和16SrRNA结合，增强其亲和力。rpsL基因突变是结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制，其常见的突变位点为43位及88位AAG→AGG，rrs最常见的突变位点发生在530环区（如419C→T、513A→C、516C→T）和915区，512、513位的碱基突变可导致高水平的耐药。最近有研究者发现编码7-甲基鸟苷酸（m7G）甲基转移酶的gidB基因突变与链霉素低水平耐药有关，gidB基因突变导致16SrRNA的530环中G527不能得到修饰而引起链霉素耐药［39］。

（二）卡那霉素

氨基糖苷类抗生素卡那霉素、阿米卡星是治疗耐多药结核病的核心二线药物。主要是与核糖体结合，抑制蛋白质的合成，从而发挥杀菌作用。

卡那霉素主要与核糖体30S亚基16Sr RNA结合，抑制结核分枝杆菌蛋白质合成。rrs基因的突变能导致对卡那霉素高水平耐药（MIC≥80μg/ml），而且一些突变能引起结核分枝杆菌对其他一些二线药交叉耐药，如阿米卡星、卷曲霉素［40］，最常见的突变是1401位A→G，少数为1402位C→T/A，1484位C→T。最近研究发现大约80%耐卡那霉素的临床分离株对卡那霉素有低水平耐药（5μg/ml＜MIC＜ 80μg/ml），该耐药株未出现rrs突变并且无交叉耐药，取而代之的是Eis蛋白的过度表达，Eis是一种氨基糖苷乙酰转移酶，能乙酰化卡那霉素和阿米卡星（乙酰化卡那霉素的效率高于阿米卡星），并有助于提高结核分枝杆菌在细胞内生存。编码Eis的eis基因（Rv2416c）起始密码子上游14 bp C→T突变使eis转录水平明显增高，Eis蛋白表达增多，氨基糖苷乙酰转移酶活性大大增强，从而导致卡那霉素耐药（这些耐药株中也存在其他突变：37 bp G→T和10 bp G→A突变也能引起eis转录水平增高，乙酰转移酶活性增强，但都明显低于14 bp C→T突变）。

虽然eis的突变也能提高阿米卡星的MIC值，但实验证实突变株仍对阿米卡星敏感。在42株临床分离株中，33株（79%）eis启动子区有突变，4株对卡那霉素敏感的菌株eis启动子区也有突变：C→12T（eis转录水平轻度增高，氨基糖苷乙酰转移酶的活性在最低水平），A→13G（eis转录水平与H37Rv无异，氨基糖苷乙酰转移酶的活性检测不到或者在最低水平）［］。

（三）卷曲霉素

卷曲霉素和紫霉素结构相似，属于环肽类抗生素，由4个结构相似的活性化合物——ⅠA，ⅠB，ⅡA和ⅡB组成，其中ⅠA和ⅠB含量占80%～90%，是发挥疗效的主要成分，对耐药菌和持留菌有很好的疗效，主要与核糖体30S亚基16SrRNA结合，抑制蛋白质合成。耐药的产生一般是由于：（1）编码rRNA修饰酶（2′-O-甲基转移酶修饰16SrRNA上的核苷C1409和23SrRNA的核苷C1920）。tly A基因突变是耐药性产生的重要原因，tly A基因突变不会引起卡那霉素、阿米卡星耐药，但可引起卷曲霉素和紫霉素交叉耐药。（2）rrs基因突变。有A1401G、C1402T和G1484T等位点突变，临床菌株中以A1401C突变最常见，且这种突变菌株多数对卷曲霉素呈低度至中度耐药，部分菌株对卷曲霉素仍敏感，A1401G突变是卡那霉素和阿米卡星与卷曲霉素部分交叉耐药的分子基础；C1402T和G1484T位点突变均可导致结核分枝杆菌对卷曲霉素高度耐药，C1402T突变与卡那霉素、卷曲霉素和紫霉素交叉耐药有关，G1484T突变导致卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素和紫霉素同时耐药。（3）结核分枝杆菌本身存在的药物作用靶标发生改变［42］。

三、氟喹诺酮类

氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）药物在抗菌作用的同时表现出良好的抗结核分枝杆菌的活性，与一线和二线抗结核药物联合组成抗结核方案，为MDR-TB的治疗开拓了广阔的前景。WHO于2008年推出的耐药结核病治疗指南把MDR-TB治疗的药品分为5组，其中第三组是氟喹诺酮类药品（氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星），并将氟喹诺酮类药物作为耐药结核病治疗中最主要的药物，其抗结核作用莫西沙星＞左氧氟沙星＞氧氟沙星。

氟喹诺酮类药物主要作用于细菌的DNA旋转酶，DNA旋转酶由gyrA和gyrB基因编码的2个A亚单位和2个B亚单位组成，gyrA基因突变与药物浓度和结构相关，gyrB基因突变可能改变了胞内药物的蓄积，而呈低水平耐药。gyrA基因编码的A亚基是氟喹诺酮类药物的主要作用位点，使DNA解旋和复制受阻，编码的gyrA基因突变导致药物结合位点构象改变，从而产生耐药。突变位点大部分为94位GAC→GCC/CAC/TAC，90位GCC→GTG，多发生在gyrA基因保守区67-106位密码子区［43］。gyrA基因90位、91位、94位和88位突变作为氟喹诺酮类药物耐药分子标记在结核分枝杆菌。氟喹诺酮类药物敏感性快速基因检测方法中已得到应用。除了gyrA 90位、91位、94位密码子的所有单碱基突变形式，gyrB GAC500AAC突变，发现了新的与耐药相关的gyrA GCG90AAG双碱基突变形式和gyrB GGG551AGG突变，新发现的突变位点在耐药中的作用还需进一步研究［44］。

MfpA（fluoroquinolone resistance protein from Mycobacterium tuberculosis）是在研究氟喹诺酮类的外排泵时从耻垢分枝杆菌基因组中克隆出来的蛋白，介导一种新的氟喹诺酮耐药机制，可导致耻垢分枝杆菌对环丙沙星和司帕沙星低水平耐药。结核分枝杆菌中发现有 Mfp A蛋白的类似物，此蛋白含有183个氨基酸残基，由Rv3361c基因编码，与含有192个氨基酸残基的Mfp A蛋白有67%的相似性，Mfp A属于细菌五肽重复家族中的一员，每隔4个氨基酸有一个亮氨酸或苯丙氨酸，Mfp A是一种能够模拟DNA的蛋白质，与DNA旋转酶A结合而抑制其活性［45］。

四、疗效尚不确切的抗结核药物

（一）新大环内酯类

新大环内酯类抗生素包括14元环（红霉素、克拉霉素）、15元环（阿奇霉素）、16元环（螺旋霉素、交沙霉素、泰沙星、卡波霉素）3大类。新大环内酯类药物对结核分枝杆菌的抗菌活性较弱，对耐药菌有一定的抗菌活性，其中罗红霉素抗菌作用最强，且与异烟肼或利福平有协同作用，其他如甲红霉素、阿奇霉素主要用于非结核分枝杆菌病的治疗。

现认为新大环内酯类药物可结合到50S亚基23SrRNA的特殊靶位，阻止肽酰基tRNA从mRNA的A位移向P位，使氨酰基tRNA不能结合到A位，抑制蛋白质的合成。erm基因编码产生的酶能将23SrRNA甲基化，阻止药物与核糖体结合。ermMT（erm37）基因属于编码23SrRNA甲基转移酶的erm基因家族，它存在所有结核分枝杆菌复合群（某些BCG菌株此基因部分缺失），高度保守，ermMT基因的存在是结核分枝杆菌复合群（某些BCG菌株除外）对大环内酯类天然耐药的主要原因［46］。

（二）利奈唑胺

噁唑烷酮类化合物是新一代全合成的抗菌药物，此类药物可阻止细菌蛋白质的早期合成反应（主要作用靶位是核糖体50S亚基的23SrRNA），与其他蛋白质合成抑制剂类抗菌药物无交叉耐药性，体内外对许多临床耐药菌有强烈的抗菌活性。

利奈唑胺是第一个应用于临床的噁唑烷酮类药物，其与核糖体50S亚基结合，抑制mRNA与核糖体结合，阻止50S 与30S亚基结合成70S核糖体，影响蛋白质合成。它的作用靶位为23SrRNA、核糖体L4和L22、Erm-37甲基转移酶以及whiB7调节蛋白等，与其他类别的抗菌药物无交叉耐药，可能由于靶位接近的缘故，利奈唑胺耐药性的产生常伴有大环内酯类耐药性的消失。细菌对利奈唑胺自然耐药的发生率低，研究者们用只有一个rRNA功能基因的耻垢分枝杆菌实验株进行诱导，得到的耐利奈唑胺菌株分2类：一类对利奈唑胺的MIC≥64 mg/L，23SrRNA的V区有突变；一类MIC为4～8 mg/L，无23SrRNA突变，说明可能存在其他耐药机制。用利奈唑胺敏感的结核分枝杆菌（MIC≤1 mg/L）诱导产生的耐药株发现了G2061T和G2576T突变，MIC分别为32 mg/L和16 mg/L，但MIC在4～8 mg/L之间的耐药株23Sr RNA基因未发现任何突变［47］。

此外，结核分枝杆菌细胞壁结构和组成的变化，菌体自身的药物外排泵系统也参与了耐药的形成。菌体的外排泵包括耐受小节分裂区家族（RND）的MmpL，小耐多药性家族（SMR）的Mmr，易化超家族（MFS）的Lfr A、Rv1634、Efp A、Tet（V）、P55、Tap、Rv1258c和ATP结合区超家族（ABC）的Drr AB、Pst、Rv2686e-Rv2687e-Rv2688c等，这些药物外排泵蛋白转运氟喹诺酮类、四环素、氨基糖苷类药物和其他化合物。

结核分枝杆菌耐药机制复杂，对不同的抗生素有不同的耐药机制，而一种抗生素耐药机制又是多样的。新型抗生素的不断开发使用，也会导致出现新的耐药。因此结核耐药机制还存在许多盲区，需要积极开展耐药机制的研究，指导临床早期分子诊断和抗生素的合理使用，对控制耐药结核的病情、感染扩散和传播意义重大。

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Advances in reseach on Mycobacterium tuberculosis drug resistance mechanism

DING Hai-rong，QIN Chuan，ZHAN Ling-jun. Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science；Peking Union Medical College Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China

Tuberculosis was one of most serious infectious diseases that were harmful to human health.Antibiotics was effective treatment against this bacterium.But the emergency of multi-and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis（Mtb）were occurred frequently when the use of antibiotics was unproper.Drug-resistant phenotype was due to mutations in drug resistant related genes，this paper will state the progress in mechanism study of drug resistant Mtb，which will guide the diagnosis and treatment of drug resistant Mtb.

Antitubercular agents； Antibiotics，antitubercular； Drug resistance，bacterial

2013-03-26）

（本文编辑：张晓进）

“十二五”国家科技重大专项（2012ZX10004501）

100021北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室

占玲俊，Email：zhanlj@cnilas.org