干细胞移植促进血管新生的研究进展

谷涌泉 佟铸

•专家论坛•

干细胞移植促进血管新生的研究进展

谷涌泉 佟铸

血管新生是机体在生理和病理状态下发生的重要过程，参与机体的诸多方面。血管新生是一个复杂的过程，可分为早期和晚期二个阶段[1]。早期阶段包括血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）的前体细胞分化、增殖、迁移，融合成初期血管网络。晚期阶段包括血管芽生、分支，形成小血管，血管支持细胞分泌充实在新生血管周围，从而在原有血管基础上形成新的成熟血管。

在阐述血管新生与肿瘤相互关系的同时，有研究预言用促进血管新生的方法即治疗性血管新生来治疗缺血性疾病的前景[2]。目前治疗性血管新生通过直接应用多种血管生成诱导剂（如局部或动脉内使用VEGF、bFGF），或采用血管生成因子相关的基因治疗方法在心脑缺血性疾病的动物实验和临床试验中已经获得显著疗效。然而，治疗性血管新生的失控性问题及不良反应等，降低了该策略的临床可行性。在治疗性血管形成方面,国内外学者应用多种干（祖）细胞在治疗下肢缺血、心肌缺血、脑缺血等方面的研究，已取得了令人鼓舞的效果[3]。

一、内皮祖细胞与血管新生

血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）被认为是血管新生的主要“物质基础”，EPC是VEC的前体，亦称成血管细胞（angioblast）[4]。该细胞最早被Asahara等[5]证明存在于循环外周血中并能分化为VEC，在缺血刺激下可通过动员到外周血，迁移、归巢到血管新生部位，并在迁移部位增殖、分化为内皮细胞（endothelial cell，EC），在体内具有明显的内皮修复及促血管新生作用。

人在病理状况下，骨髓中的EPC可以被动员到外周血中，逐渐迁移、定居于缺血组织，并分化、嵌合入新血管，该过程也分别称为EPC的动员、归巢和分化。大多数研究表明EPC血管新生的机制可能有两方面：一是迁移到局部分化成成熟的EC；二是通过自分泌和旁分泌机制分泌促血管生成因子，如VEGF、HGF、IGF-1、G-CSF等[6]。

EPC能促血管新生和修复内皮：EPC属于干细胞，它促进血管形成而无需依赖血管系统，其作用机制主要有两个方面：一是分泌功能，有研究发现体外培养的EPC能够分泌促血管生长因子，如VEGF、粒细胞克隆刺激因子、粒巨细胞克隆刺激因子等，二是EPC的归巢作用，当血管出现损伤时候，EPC通过归巢能直接到达受损的血管，进而分化、发育为新生管,并参与血管新生和内皮损伤修复[7]。

Tateishi-Yuyama等[8]首次报道应用自体单个核细胞（富含EPC）移植治疗下肢缺血性疾病，开创了血管新生在临床应用的先例。笔者首先在国内应用自体单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病并取得了成功[9]，目前已经治疗了500余例患者，取得了令人兴奋的疗效[10-12]。笔者不仅采用了国外的方法，即下肢肌肉局部注射，而且还在国际上率先采用了经下肢动脉导管注射的新方法，对这2种不同自体骨髓干细胞移植的方法治疗严重下肢缺血性疾病进行了对比。发现这2种方法的疗效差异无统计学意义。

中国医学科学院天津血液病研究所黄平平等[13]在采用外周血单个核细胞治疗白血病的基础上，采用类似的技术手段，在国际上最早开展了自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血并取得了成功，他们研究的临床效果很令人鼓舞。笔者和沈阳空军第463医院也相继开展此技术[14-15]，于2003年12月，到目前为止已经治疗200余例患者，大多数患者的临床症状明显改善。因此认为：自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病也是一种简单、安全、有效的方法，然而由于骨髓动员期间，外周血液循环中单个核细胞的量增加明显，外周血的黏稠度明显增加，血管内血栓形成的机会大大增加，从而增加心肌梗死或脑梗塞发生的危险。在临床研究中就出现了1例心肌梗死和2例脑梗塞，由于骨髓动员早期就采用了正规的抗凝措施，这些并发症表现比较轻微，没有引起严重后果。因此，在整个过程中需要注意心脑血管并发症的发生。

在单纯骨髓单个核细胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400 ～ 500 ml，得到的骨髓单个核细胞总数在（1 ～ 3）×109个。由于患者大多年龄比较大，体弱并多伴有其他疾病，如冠状动脉硬化性心脏病或（和）脑动脉硬化症等，如果一次抽取过多的骨髓血，势必造成其他并发症。在以往的研究中发现：在同等条件下，疗效与细胞总数正相关，即量越大，效果越好。如何在减少每次骨髓血抽取的总量，同时又能增加或至少不降低疗效，这是一个挑战。经过努力，已经找到了一种新的方法，就是骨髓动员刺激以后的骨髓干细胞移植，也称之为“改良的骨髓单个核细胞移植”[16]。主要步骤是在抽取骨髓前使用粒细胞集落刺激因子（GSF）刺激骨髓2 ～ 3 d，每天300 μg；然后抽取骨髓血110 ～ 200 ml，在干细胞实验室分离纯化后再进行移植。从资料中发现：无论是主观评价指标，或是客观评价指标均比以前研究结果的疗效明显提高，而且不良反应也较外周血单个核细胞为少。因此，经过骨髓动员刺激后的骨髓单个核细胞移植下肢缺血，具有抽取骨髓血少，细胞量多，近期效果好，且安全性高的优点。这些优势也在笔者最近完成的随机对照研究中得到了证实。因此可以说这种技术是除自体骨髓单个核细胞移植和外周血单个核细胞移植以外的又一种治疗下肢缺血的新方法，而且随访结果也显示这是一种值得推广的方法。

中远期随访结果也显示了无论采用骨髓血来源或是外周血来源的单个核细胞在治疗下肢慢性缺血方面具有一定的效果，更重要的是非常安全[17]。

二、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）与血管新生

MSC是干细胞的一种类型,具备干细胞的自我增殖能力和多向分化潜，广泛存在于全身的结缔组织和器官间质中。由于取材容易，易分离,体外可大量扩增，因此，MSC在现代细胞治疗中应用前景广阔，它可用于修复受伤或病变的多种组织器官，可治疗心血管疾病[18]、神经系统疾病、骨组织病、烧伤烫伤、缺血性血管病、肿瘤等多种疾病。研究表明，适宜条件下MSC具有分化为几乎所有三胚层类型细胞的能力。已有研究证实MSC可向EC分化[19]，并可促进肿瘤血管形成[20]。当然也有研究者指出MSC能够抑制EC的增殖和血管新生[21]。

MSC其促血管生长作用机制可能为：MSC含有EC的前体细胞参与血管新生。实验中观察到MSC分化形成EC参与了血管形成。MSC可形成和分泌许多血管活性生长因子促进血管新生，血管内皮生长因子（VEGF）是促进血管生长的主要因子之一，它不仅在生理状态下促进新生血管形成，而且在病理状态下的新生血管形成中亦起作用[22]。

三、脐血或脐带血干细胞与血管新生

实验研究证实，从脐血CD133+细胞中可诱导出内皮祖细胞，表现为表达EC标志的贴壁细胞[23]，移植后的内皮祖细胞可以在缺血组织分化成EC，整合到缺血部位新生血管内，移植EPC后裸鼠缺血后肢的毛细血管密度、血流灌注及坏死程度均较对照组明显改善。有作者发现脐血单个核细胞在VEGF等细胞因子的诱导下可定向分化为EC。在临床中有作者对脐血干细胞移植进行了初步尝试，Kim等[24]应用脐血干细胞移植治疗Buerger's病，结果显示：细胞移植后患者静息痛缓解、肢体皮肤溃疡4周内愈合，血管阻力降低，血管造影显示肢体远端毛细血管密度增加、直径增大。

脐血来源丰富，通常被认为医疗废物而丢弃，利用脐血进行干细胞研究等于废物利用，变废为宝；脐血的收集过程无创、无痛苦、易被孕妇及其家属接受。相对胚胎干细胞而言,虽然脐血干细胞在分化潜能上不及胚胎干细胞,但是避免了胚胎干细胞研究伦理争论的焦点问题，应用脐血干细胞进行治疗社会伦理学障碍较小。由于以上优点，目前认为脐血可能是细胞移植的较好来源，具有广泛的应用前景[25]。

从1988年第1例脐带血干细胞移植以来，全世界超过150个国家和地区已进行了不少于6000例脐带血干细胞移植。我国先后设置的10个脐血库中，保存合格脐带血共计20 000余份。国内北京、天津、山东和广东4个脐血库已提供临床移植应用，其中天津脐血库已提供了多份5 ～ 6个HLA2A、B、DR位点相合的脐带血，可供选择供体脐血干细胞的范围已由同种同基因脐血，扩展到同种异基因脐血干细胞。

研究表明,尽管脐血和骨髓中所含CD34+细胞的百分比无显著性差异，但在质量上却有差异，CD34+细胞体外长期培养中的初始细胞CD34+CD45+细胞在脐血中明显高于骨髓，且脐血CD34+CD38-细胞的增殖分化能力高于骨髓。亦有结果显示脐血富含CD34和CD133共同表达的EPC。同时研究发现与骨髓和外周血相比，脐血干细胞还具有相对较原始、淋系祖细胞的含量少、免疫原性较弱、能耐受更大程度上的HLA配型不符等生物学特性[26]。

四、脂肪干细胞与血管新生

Zuk等[27]首先通过脂肪抽吸术从脂肪组织中分离出一群具有多向分化潜能的成纤维细胞型细胞，这种细胞被称为脂肪干细胞，这类干细胞原代是异质性的，但大部分来源于间叶细胞，仅见微量EC、平滑肌细胞和周细胞，经过几次传代以后细胞就会达到同质性。研究表明，脂肪干细胞和骨髓MSC十分相似，二者都代表了通过培养瓶内黏附法从脂肪库中分离的基质细胞部分。在形态学上，ASC与BMSC均表现为似成纤维细胞状,故难以就形态上进行区分，而二者的细胞表面抗原标志也大部分相同[28]。有学者观察了ASC随着培养传代其免疫表型的变化，发现间充质细胞相关标志在初分离的间质血管碎片（SVF）中水平很低，随着传代次数增加而迅速升高。干细胞相关标志CD34在整个培养和传代过程中都有表达，但在SVF和传代早期的ASC中最高。EC相关的CD31、CD144和血管内皮生长因子受体2在SVF中低表达，并且随着传代无明显改变。

ASC与BMSC不仅具有相似的细胞形态及细胞表面标志，也具有相似的分化功能。ASC作为一种多能干细胞，与BMSC一样，在恰当的诱导下，可分化成为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、EC、上皮细胞、神经细胞、肝细胞、胰岛细胞、表皮细胞和真皮细胞等，表明其具有跨胚层、跨系分化的潜能。与BMSC相比，ASC具有以下优点:脂肪组织储量丰富，来源充足，组织获取方法简单，只需通过吸脂术等简单的手术方法，不会给患者造成较大的疼痛和二次伤害，脂肪组织中干细胞含量丰富，比BMSC高出500倍，ASC增殖能力强，多次传代后仍然保持遗传性状稳定，具有较低的衰老程度，属自体移植，无免疫排斥反应，不涉及医学伦理学问题[29]。

目前脂肪干细胞在缺血性疾病中的应用研究已受到越来越多的关注，其中以缺血性心脏病和一些外周血管疾病尤甚。虽然目前脂肪干细胞的应用研究多停留在动物实验阶段，但已有一些临床研究的早期结果表明，ASC应用于缺血性病变治疗具有良好的效果。有研究者采用多点肌肉内注射对15例下肢重度缺血的患者进行脂肪干细胞移植，在6个月的随访期间内未出现并发症，患者疼痛明显缓解，间歇跛行距离明显增加，临床症状改善率达到66.7﹪。脂肪干细胞移植前后动脉造影显示：细胞移植后大量的侧枝血管建立[30]。

五、iPS细胞与血管新生

2006年Takahashi和Yamanaka[31]将小鼠的成纤维细胞诱导为iPS细胞。次年他们又利用4种同样的转录因子将人的皮肤成纤维细胞诱导为iPS 细胞。2007年Tmson等筛选出了另外一套用于诱导的基因组合—Oct4、Sox2、Nanog、Lin28。随后，他们利用这4种因子使人类新生儿成纤维细胞重构为iPS细胞。这两项发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。2008年Schenke-Layland等[32]将鼠皮肤细胞重编程为iPS细胞，并成功地使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。

iPS细胞研究面临的问题及应用前景：(1)效率问题。目前，诱导产生iPS细胞的效率仍然很低，这与基因导入的方式、整合位点和表观遗传学等多种因素有关。这已成为制约iPS由实验室走向临床的最大瓶颈。因此, 如何提高iPS细胞的制备效率仍是人们普遍关注的问题。(2)安全性问题。现在诱导iPS细胞通常借助逆转录病毒为载体，将几种癌基因转入分化细胞诱导其成为iPS细胞，而这种方法就有可能会因为外源基因插入细胞基因组，干扰了内源基因的表达,从而诱发癌症。iPS细胞的安全性问题限制了其在临床上的应用，建立高效、安全、实用的制备iPS细胞方法是目前研究的重点[33]。

目前iPS细胞在血管新生中的研究尚处于起步阶段，有许多关键问题有待解决。但可以相信随着iPS研究的进一步深入，iPS安全问题的有效控制，其将在血管新生过程中扮演越来越重要的角色。

1 Yılmaz I, Bayraktar N, Ceyhan K, et al. Evaluation of vascular endothelial growth factor A and endostatin levels in induced sputum and relationship to bronchial hyperreactivity in patients with seasonal allergic rhinitis[J]. Am J Rhinol Allergy, 2013, 27(3):181-186.

2 Al-Husein B, Abdalla M, Trepte M, et al. Antiangiogenic therapy for cancer: an update[J]. Pharmacotherapy, 2012, 32(12):1095-1111.

3 Lee EJ, Park HW, Jeon HJ, et al. Potentiated therapeutic angiogenesis by primed human mesenchymal stem cells in a mouse model of hind limb ischemia[J]. Regen Med, 2013, 8(3):283-293.

4 Palladino M, Gatto I, Neri V, et al. Combined therapy with sonic hedgehog gene transfer and bone marrow-derived endothelial progenitor cells enhances angiogenesis and myogenesis in the ischemic skeletal muscle[J]. J Vasc Res, 2012, 49(5):425-431.

5 Asahara T, Takahashi T, Masuda H, et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. EMBO J, 1999, 18(14):3964-3972.

6 Aburakawa Y, Kawabe J, Okada M, et al. Prostacyclin stimulated integrin-dependent angiogenic effects of endothelial progenitor cells and mediated potent circulation recovery in ischemic hind limb model[J]. Circ J, 2013, 77(4):1053-1062.

7 Crestani B, Valeyre D, Gaussem P, et al. Imbalance of circulating endothelial cells and progenitors in idiopathic pulmonary fi brosis[J]. Angiogenesis, 2013, 16(1):147-157.

8 Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial[J]. The Lancet, 2002, 360(9331):427-435.

9 谷涌泉, 郭连瑞, 张建, 等.自体骨髓干细胞移植治疗严重下肢缺血1例[J]. 中国实用外科杂志, 2003, 23(11):670.

10 谷涌泉, 张建, 齐立行, 等. 自体骨髓单个核细胞移植治疗慢性下肢缺血94例不同病变分期患者的效果比较[J]. 中国临床康复杂志, 2005, 9(38):7-10.

11 Gu YQ, J Zhang, Guo LR, et al. Transplantation of autologus bone-marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischeia[J]. Chin Med J, 2008, 121(11):963-967.

12 谷涌泉, 张建, 齐立行, 等.自体骨髓单个核细胞不同移植浓度对治疗下肢缺血的临床疗效的影响[J]. 中国修复重建外科杂志, 2006, 5(20):149-152.

13 黄平平, 李尚珠, 韩明哲, 等.自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉硬化性闭塞症[J]. 中华血液学杂志, 2003, 24(6):308-311.

14 谷涌泉, 张建, 苏力, 等.自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血53例的临床研究[J]. 中华普通外科杂志, 2006, 21(12):844-847.

15 杨晓凤, 吴雁翔, 王红梅, 等.自体外周血干细胞移植治疗62例缺血性下肢血管病的临床研究[J]. 中华内科杂志, 2005, 44(2):95-98.

16 谷涌泉, 张建, 郭连瑞, 等. 骨髓动员刺激后自体骨髓源单个核细胞移植治疗下肢缺血的临床研究[J].中国修复重建外科杂志, 2006, 20(10):1017-1020.

17 谷涌泉, 齐立行, 张建, 等.自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血的中期疗效[J].中国修复重建外科杂志, 2009, 23(3):66-69.

18 Karpov AA, Uspenskaya YK, Minasian SM, et al. The effect of bone marrow- and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation on myocardial remodelling in the rat model of ischaemic heart failure[J]. Int J Exp Pathol, 2013, 94(3):169-177.

19 Rao RR, Peterson AW, Ceccarelli J, et al. Matrix composition regulates three-dimensional network formation by endothelial cells and mesenchymal stem cells in collagen/fibrin materials[J]. Angiogenesis, 2012, 15(2):253-264.

20 Uchibori R, Tsukahara T, Mizuguchi H, et al. NF-κB activity regulates mesenchymal stem cell accumulation at tumor sites[J]. Cancer Res, 2013, 73(1):364-372.

21 Menge T, Gerber M, Wataha K, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit endothelial proliferation and angiogenesis via cell-cell contact through modulation of the VECadherin/β-catenin signaling pathway[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(1):148-157.

22 Sheikh AM, Nagai A, Wakabayashi K, et al. Mesenchymal stem cell transplantation modulates neuroin fl ammation in focal cerebral ischemia:contribution of fractalkine and IL-5[J]. Neurobiol Dis, 2011, 41(3):717-724.

23 Senegaglia AC, Barboza LA, Dallagiovanna B, et al. Are purified or expanded cord blood-derived CD133+cells better at improving cardiac function?[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2010, 235(1):119-129.

24 Kim SW, Han H, Chae GT, et al. Successful stem cell therapy using umbilical cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model[J]. Stem Cells, 2006, 24(6):1620-1626.

25 Anderson DG, Markova D, An HS, et al. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in the cultured rabbit intervertebral disc:a novel cell source for disc repair[J]. Am J Phys Med Rehabil, 2013, 92(5):420-429.

26 Phuc PV, Nhung TH, Loan DT, et al. Differentiating of banked human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into insulin-secreting cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2011, 47(1):54-63.

27 Zuk PA. Viral transduction of adipose-derived stem cells[J].MethodsMol Biol, 2011, 702:345-357.

28 Hsiao ST, Asgari A, Lokmic Z, et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue[J]. Stem Cells Dev, 2012, 1(12):2189-2203.

29 Kishimoto S, Ishihara M, Mori Y, et al. Three-dimensional expansion using plasma-medium gel with fragmin/protamine nanoparticles and fgf-2 to stimulate adipose-derived stromal cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Biores Open Access, 2012, 1(6):314-323.

30 Lee HC, An SG, Lee HW, et al. Safety and effect of adipose tissue-derived stem cell implantation in patients with critical limb ischemia: a pilot study[J]. Circ J, 2012, 76(7):1750-1760.

31 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by de fi ned factors[J]. Cell, 2006, 126(4):663-676.

32 Schenke-Layland K, Rhodes KE, Angelis E, et al. Reprogrammed mouse fibroblasts differentiate into cells of the cardiovascular and hematopoietic lineages[J]. Stem Cells, 2008, 26(6):1537-1546.

33 Steinemann D, Göhring G, Schlegelberger B. Genetic instability of modified stem cells-a first step towards malignant transformation?[J]. Am J Stem Cells, 2013, 2(1):39-51.

2013-03-19)

(本文编辑：陈媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.001

北京市科技计划项目(Z121100005512009)；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划—学科骨干(2009-3-59)；结构类组织的组织工程构建技术与产品研发(2012AA020507)；干细胞移植治疗心力衰竭的临床前评价和临床研究 (2011AA020101)

首都医科大学宣武医院血管外科 首都医科大学血管外科研究所

谷涌泉，Email：ydjiang202@yahoo.com.cn

谷涌泉，佟铸.干细胞移植促进血管新生的研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志：电子版, 2013, 3(2):56-60.