卡托普利对大潮气量机械通气大鼠肺组织小窝蛋白-1表达的影响

陈丽丽 张新日 李 阳

陈丽丽，张新日.卡托普利对大潮气量机械通气大鼠肺组织小窝蛋白-1表达的影响［J/CD］.中华肺部疾病杂志:电子版，2013，6(1):46-50.

呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury，VILI)是机械通气的严重并发症，也是目前医学界研究的热点问题。据文献报道，小窝蛋白-1(cavedin，Cav-1)在肺组织中的表达水平减低参与了VILI的发病过程，但其机制尚不明确［1］。近年来研究发现，血管平滑肌细胞上Cav-1的表达水平受AngⅡ的调节［2］。但VILI时肺组织中Cav-1表达是否受AngⅡ的调节，应用血管紧张素转换酶抑制剂能否增加Cav-1的表达水平尚有待深入研究。本实验通过观察血管紧张素转换酶抑制剂—卡托普利干预后大鼠肺组织AngⅡ及Cav-1表达量的变化，旨在探讨卡托普利对大潮气量机械通气致大鼠急性肺损伤的防治作用。

材料与方法

一、动物分组与处理

24只雄性健康 Sprague-Dawley大鼠(体质量300～350 g，山西医科大学实验动物中心提供)，随机分为3组，每组8只动物:①对照组:未行机械通气;②大潮气量组(H-VT组):VT:40 ml/kg;③卡托普利干预组(CAP组):通气前30 min经腹腔注射卡托普利(100 mg/kg)。

25%乌拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行气管切开气管插管术。除对照组外，余各组大鼠均与小动物呼吸机(DH-150型，浙江大学医学仪器厂制造)相连行机械通气。机械通气参数统一设置为:VT:40 ml/kg，f:60 次/min，I/E:1/3，PEEP 为0，吸入气体为室内空气，通气时间为2 h。

二、标本收集与制备

通气结束后，腹主动脉放血处死大鼠，完整切取肺脏。左肺行支气管肺泡灌洗术(4℃生理盐水灌注4 ml×4次，回收量大于80%)，支气管肺泡灌洗液 (bronchialalveolarlavage fluid， BALF)经3000 r/min离心10 min，取上清液－70℃冻存待测;取右肺上叶－70℃冻存，用于测定AngⅡ含量;取右肺中叶计算肺组织干/湿(W/D)比值;取右肺下叶用4%福尔马林液固定，行石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肺组织的病理学改变，免疫组织化学法(SABC法)检测肺组织Cav-1的表达水平。

三、检测方法

1.肺组织W/D比值测定:取右肺中叶，用生理盐水冲洗干净表面血迹，无菌纱布吸干表面液体后称重(即湿重)，后置于60℃烤箱中过夜，再称重(即干重)，计算肺组织W/D比值。

2.BALF中总蛋白(TP)含量测定:采用BCA法(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供)测定BALF中TP含量，操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

3.肺组织中AngⅡ含量测定:将右肺上叶置于裂解液中，用组织匀浆机打碎后离心，取上清液用ELISA法检测肺组织中AngⅡ含量(试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司)，严格按试剂盒说明书进行操作。在酶标仪(wellscan Mk3，芬兰)上测出标准品吸光度后绘制出标准曲线，然后根据测得的样品吸光度数值在标准曲线上读出样品含量。

4.肺组织Cav-1表达测定:采用免疫组织化学法(SABC)测定肺组织Cav-1的表达。严格参照试剂盒说明书(试剂盒购自Cell Signaling Technology)进行操作。兔抗大鼠抗体工作浓度为1︰800，以磷酸盐缓冲液(phosphate duffer sdution，PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判断:细胞膜呈棕黄色为阳性染色。在400倍光学显微镜下对每张组织切片随机选取5个视野进行观察，用BI-2000医学图像分析系统检测每个视野的光密度值，取上述5个视野的平均光密度值作为该组大鼠肺组织Cav-1表达的相对含量。

四、统计学方法

结 果

一、肺组织病理学改变

HE染色光学显微镜下观察，对照组大鼠各级支气管上皮和肺泡结构完整，肺泡间隔正常，肺间质无炎性细胞浸润。H-VT组大鼠可见大量炎性细胞浸润和弥漫性肺间质水肿，肺泡间隔明显增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔内有血性液体且有炎性细胞浸润。CAP组大鼠肺也可见到炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚，但较H-VT组明显减轻(图1～3)。

图1 对照组大鼠肺泡结构完整，肺泡间隔基本正常(HE×250)

图2 H-VT组大鼠肺泡间隔弥漫性水肿、增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔内有血性液体渗出及炎性细胞浸润(HE×250)

图3 CAP组大鼠肺泡间隔度轻度水肿、增厚，少部分肺泡破裂融合，肺泡腔见少量炎性细胞浸润(HE×250)

二、肺组织W/D比值测定结果

各组大鼠肺组织W/D比值测定结果见表1。结果显示，与对照组相比，H-VT组和CAP组大鼠肺组织W/D比值均明显升高(均P＜0.01)，但CAP组大鼠肺组织W/D比值较H-VT组明显减低(P＜0.01)。

表1 各组大鼠肺组织W/D比值测定结果(±s)

表1 各组大鼠肺组织W/D比值测定结果(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01，bP＜0.01

组 别 n W/D 比值对照组84.0625 ±0.27322 H-VT 组 8 7.1875 ±0.34112a CAP 组 8 4.8913 ±0.43927ab

三、BALF中TP含量测定结果

各组大鼠BALF中TP含量测定结果见表2。结果显示，与对照组相比，H-VT组和CAP组大鼠BALF中TP含量均明显升高(均P＜0.01)，但CAP组大鼠BALF中TP含量较H-VT组明显减低(P＜0.01)。

表2 各组大鼠BALF中TP测定结果(±s)

表2 各组大鼠BALF中TP测定结果(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01，bP＜0.01

组 别 n BALF中TP 含量对照组80.2238 ±0.03662 H-VT 组 8 0.5413 ±0.05463a CAP 组 8 0.4550 ±0.06568ab

四、肺组织AngⅡ含量测定结果

各组大鼠肺组织AngⅡ含量测定结果见表3。结果显示，CAP组和对照组大鼠肺组织AngⅡ含量相比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但H-VT组大鼠肺组织AngⅡ含量均明显高于对照组和CAP组(均P＜0.01)。

表3 各组大鼠肺组织AngⅡ含量测定结果(±s)

表3 各组大鼠肺组织AngⅡ含量测定结果(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01，bP＜0.01

组 别 n 肺组织AngⅡ含量对照组8116.7500 ±11.39078 H-VT 组 8 376.0100 ±21.43080a CAP 组 8 132.2563 ±14.35712ab

五、肺组织Cav-1表达水平测定结果

各组大鼠肺组织Cav-1表达水平测定结果见表4。结果显示，H-VT组Cav-1表达水平均明显低于对照组和CAP组(均P＜0.01)，CAP组大鼠肺组织 Cav-1表达水平低于对照组(P＜0.01)，(图4～6)。

表4 各组大鼠肺组织Cav-1表达量测定结果(±s)

表4 各组大鼠肺组织Cav-1表达量测定结果(±s)

注:与对照组比较:aP＜0.01，bP＜0.01

组 别 n Cav-1表达量对照组80.55625 ±0.039856 H-VT 组 8 0.27875 ±0.048544a CAP 组 8 0.43688 ±0.06312ab

图4 对照组大鼠肺组织Cav-1(SABC×400)

图5 H-VT组大鼠肺组织Cav-1(SABC×400)

图6 CAP组大鼠肺组织Cav-1(SABC×400)

六、肺组织Cav-1与AngⅡ含量的相关性分析各组大鼠肺组织Cav-1与肺组织AngⅡ含量之间呈负相关(r= －0.821，P＜0.01)。

讨 论

近年来通过对信号转导系统的研究发现，大多数细胞膜上存在直径约50～100 nm的囊性凹陷结构—小窝(caveolae)，其不仅参与跨膜物质转运，而且是细胞信号分子富集和信号转导的枢纽［3］。小窝蛋白(caveolae pratein)是小窝的主要结构蛋白和活性成分，其中cav-1广泛存在于肺组织中［4］。研究发现，Cav-1通过其“脚手架”域与多种下游信号转导分子相互作用，调节其活性状态。当细胞受到适宜刺激后，Cav-1随即激活，与其相耦联的下游信号转导分子产生一系列生物学效应［3］。

有研究表明，Cav-1通过中性粒细胞介导的炎症反应参与急性肺损伤的发生和发展［4］。最新研究发现，CO在机械通气过程中发挥的抗炎保护作用部分是通过诱导Cav-1高表达实现的［1］。与野生型小鼠相比，Cav-1基因敲除小鼠在机械通气后肺组织损伤程度明显加重，其支气管肺泡灌洗液中的蛋白含量和细胞计数比野生型小鼠升高3～5倍。因此我们推测，Cav-1在机械通气过程中可能通过调控多种信号转导分子的活性，参与VILI的发病过程，但其具体作用机制尚不清楚。

近年来，肾素 －血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)在急性肺损伤中的作用引起了人们的广泛关注，其中以AngⅡ及其1型受体的作用最为突出［5-9］。研究发现，大潮气量机械通气所致急性肺损伤与RAS系统激活有关，使用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂均可减轻肺损伤程度，但RAS系统激活是否与Cav-1信号通路有关目前尚无定论［5］。

本实验研究显示:H-VT组大鼠肺组织AngⅡ含量、肺组织W/D比值及BALF中TP含量均明显高于对照组，而肺组织Cav-1的表达水平明显低于对照组，且大鼠肺组织中Cav-1表达水平与AngⅡ含量之间呈负相关。说明AngⅡ可通过下调Cav-1在肺组织中的表达水平，在VILI发病机制中起一定作用。其作用机制可能是机械牵拉刺激使肺组织血管紧张素转换酶活性升高，生成大量AngⅡ，后者通过某种信号转导通路下调Cav-1的表达水平，从而使Cav-1对其相耦联的下游信号转导分子的抑制作用减弱，最终激活多种炎性细胞并产生大量致炎因子，导致肺组织的损伤。

卡托普利属于血管紧张素转换酶抑制剂，能抑制血管紧张素转换酶的活性，减少AngⅡ的生成，可减轻由AngⅡ所引起的肺组织炎症反应。本实验结果显示，CAP组大鼠肺组织病理损伤程度较H-VT组明显减轻，同时其肺组织AngⅡ含量、肺组织W/D比值、BALF中TP量均较H-VT组明显降低，而肺组织Cav-1的表达水平较H-VT组明显增加。说明卡托普利可通过抑制AngⅡ生成，进而上调Cav-1的表达水平，对VILI具有一定保护作用。

综上所述，机械刺激可使肺组织AngⅡ生成增多，后者通过下调肺组织Cav-1的表达水平参与VILI的发病过程。卡托普利通过抑制AngⅡ生成，上调肺组织Cav-1的表达水平，对VILI具有一定的防治作用。但AngⅡ通过何种信号转导途径来调控肺组织Cav-1的表达水平尚有待深入研究。

1 Hoetzel A，Schmidt R，Vallbracht S，et al.Carbon monoxide prevents ventilator induced lung injury via caveolin-1［J］.Crit Care Med，2009，37:1708-1715.

2 Ishizaka N，Griendling KK，Lassègue B，et al.AngiotensinⅡ type 1 receptor:relationship with caveolae and caveolin after initial agonist stimulation［J］.Hypertension，1998，32(3):459-466.

3 孙东明.小窝、小窝蛋白与细胞信号转导［J］.国外医学(生理、病理科学与临床分册)，2002，22(3):245-247.

4 Jin Y，Lee SJ，Minshall RD，et al.Caveolin-1:a critical regulator of lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300(2):151-160.

5 Jerng JS，Hsu YC，Wu HD，et al.Role of the renin-Angiotensin systerm in ventilator-induced lung injury:an in vivo study in a rat model［J］.Thorax，2007，62(6):527-535.

6 Chen CM，Chou HC，Wang LF，et al.Captopril decreases plasminogen activator inhibitor-1 in rats with ventilator-induced lung injury［J］.Crit Care Med，2008，36(6):1880-1885.

7 Lukkarinen H，Laine J，Lehtonen J，et al.AngiotensinⅡ Receptor blockade inhibits pneumocyte apoptosis in experimental meconium aspiration［J］.Pediatres，2004，55(2):326-333.

8 Jiang JS，Wang LF，Chou HC，et al.Angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril attenuates ventilator-induced lung injury in rats［J］.J Appl Physiol，2007，102(6):2098-2103.

9 Neyrinck AP，Matthay MA.The role of angiotensin-converting enzyme inhibition in endotoxin-induced lung injury in rats［J］.Crit Care Med，2009，37(2):776-777.