东北雷公藤对小鼠血液及肝脏的影响

苗婷婷，张建平，宫汝淳，何晓燕，赵玉敏，乔淑芬

(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化134002)

东北雷公藤(TripterygiumregeliiSpragueetTakeda)为卫矛科雷公藤属多年生草本植物，为野生药用植物[1]，分布于东北三省．其功能主要为祛风除湿，解毒杀虫，利水消肿，外用治风湿性关节炎.该物种为中国植物物种编目数据库收录的有毒植物，其毒性为全株有毒.随着东北雷公藤研究的不断深入及其广泛的研发应用，仅20余年的时间，其资源就已经大幅减少甚至面临枯竭.东北雷公藤在我国研究的已经比较广泛，但多见于对其药效及临床上的研究，对毒副作用的病理学研究较少，东北雷公藤对组织学的影响更是少见报道，本实验通过白细胞计数和制作组织切片，观察东北雷公藤对小鼠白细胞数目及肝组织结构的影响，以期为病理学研究、有效开发及临床应用提供可靠的理论依据，对今后研究降低或消除其毒性提供依据.

1 实验材料

1.1 实验动物

小鼠100只，体重(25±2)g，雄性，购于长春市高新经济动物养殖中心.

1.2 实验药品

东北雷公藤于秋季采自吉林省通化市通化师范学院后山，并经鉴定.注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，四氯化碳(湖南师大化学试剂厂)，其它试剂均为分析纯试剂.

1.3 实验仪器

中药粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司，FW100)，显微图像分析仪(德国莱卡，M165C-3D)，数字冰冻切片机(德国莱卡3050S)，索氏提取器等.

2 实验过程

2.1 药物提取及试剂配制

称取东北雷公藤130g，粉碎后放入大烧杯中用95%乙醇，以固液比1g:10ml浸提．浸泡3次，4h/次，得到粗提液[2].将粗提液置于索氏提取器中用95%乙醇以3倍体积百分数回流3次，每次2h，过滤，合并3次滤液.将合并滤液置于分液漏斗中，用正丁醇进行萃取，150ml/次.电磁炉加热2h，挥尽正丁醇，冷却后得到黄色晶体，纯化后产品重量为2.38g，分别根据东北雷公藤3个实验组小鼠不同给药量(1.2mg/kg、2.4mg/kg、3.6mg/kg)精密称取0.3g、0.6g、0.9g提纯产品，溶于蒸馏水配制成30ml溶液，即浓度为10g/L、20g/L、30g/L的中药混合提取液.

2.2 实验方法

(1)小鼠白细胞数目的测定.取50只小鼠，随机分为5组，每组10只，分别是：正常组，环磷酰胺组，东北雷公藤高浓度组、中浓度组、低浓度组.实验前小鼠适应性喂养7d，给药前禁食12h，自由饮水，给药后禁食4h.

正常组不做处理，正常喂养7d.环磷酰胺组在第6天腹腔注射环磷酰胺300mg/(kg·d)，用生理盐水稀释.每只小鼠注射0.2ml，观察24h.东北雷公藤高、中、低浓度组(给药浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L)用事先提取好的中药混合提取液进行灌胃，每天1次，每次0.2ml，持续7d.第7d后，用颈椎脱臼法把各组小鼠处死，收集心脏中血液.用吸管分别吸取各组血液0.02ml，放入0.38ml白细胞稀释液中，擦净吸管外沾附的血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，摇匀.将白细胞混悬液滴入计数池内，静置2～3min，待白细胞下沉后计数.在低倍镜下观察，白细胞呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特点可与杂质相区别.计数：计数池四角的4个大方格中所有的白细胞数，将总数乘以50，即得每立方毫米的白细胞数.

(2)小鼠肝组织切片的制备.取50只小鼠，随机分为5组，每组10只，分别是：正常组，四氯化碳组，高浓度组、中浓度组、低浓度组.正常组及实验组的处理方法同(1).四氯化碳组在第6d腹腔注射0.1%(v/v)四氯化碳花生油溶液10ml/kg，构建小鼠急性肝损伤模型[3].禁食，不禁水．第7d后，用颈椎脱臼法将各组小鼠处死，收集肝脏，用4%甲醛固定24h，用数字冰冻切片机切片，再将切片染色，用显微图像分析系统进行观察分析．

3 结果与分析

3.1 东北雷公藤对小鼠一般特征的影响

与正常组比较，环磷酰胺和四氯化碳组腹腔注射24h后，小鼠活动度减低，反应迟钝，食量减少，眼角分泌物增多．实验组给药7d后，低浓度组与正常组比较无明显变化；中浓度组小鼠毛松散，活动度降低；高浓度组小鼠反应迟钝，食量减少甚至拒食，眼角分泌物增多，第7d小鼠出现抽搐、昏迷、死亡现象．

3.2 东北雷公藤对小鼠白细胞数目的影响

在显微镜下观察，与正常组比较，环磷酰胺组小鼠白细胞数目显著下降(P<0.01)，东北雷公藤3个浓度组白细胞数目：低浓度组没有明显变化；中浓度组白细胞数目低于正常组(P<0.05)，接近环磷酰胺组；高浓度组的白细胞数目明显低于正常组(P<0.01)，低于环磷酰胺组(P<0.05)．

表1 东北雷公藤对白细胞数目的影响

与正常组比较，﹡表示差异显著(P<0.05)，﹡﹡表示差异极显著(P<0.01)．

3.3 东北雷公藤对小鼠肝组织结构的影响

由图1可以看出，正常组肝细胞形态结构正常，细胞核染色较浅，核质分布均匀，中央静脉清晰可见，肝索呈放射状排列规则，肝小叶结构清晰．四氯化碳组肝细胞排列紊乱，肝小叶界限不清晰，可见四氯化碳对肝脏造成了非常严重的损伤．东北雷公藤各浓度组肝脏均有不同程度的病变，核大小不一，部分皱缩，肝窦内可见崩解的核碎片及坏死细胞的残骸，细胞窦面及毛细胆管面微绒毛轻度肿胀．

4 讨论

东北雷公藤与雷公藤是同属植物，功效相似，有剧毒．经研究雷公藤对血液系统的损害主要表现为减少红细胞、白细胞和血小板，本实验结果与此相符．肝脏是哺乳动物最大的消化腺，其最重要的生理功能就是解毒，血液从消化道带来的一些有毒物质都可在肝脏中经氧化过程等减轻毒性，而雷公藤提取物具有强烈毒性，在进入体内消化的过程中不能被肝脏有效的进行分解，并对肝脏造成损伤，浓度越高造成的损伤程度越严重[4]．我们的实验结果与此相似，说明东北雷公藤中的毒性物质可以对小鼠的肝脏造成损伤．

a 正常组 b 低浓度组 c 中浓度组 d 高浓度组 e 四氯化碳组

图1肝组织显微结构(10×10)

参考文献：

[1]乔淑芬，李杰，顾地周，等.基于均匀设计法评价东北雷公藤对油松毛虫的触杀活性[J].安徽农业科学，2009，37(28):13669-13670.

[2]林剑锋，朱慧，郑友兰，等.雷公藤内酯醇诱导的血栓性浅静脉炎[J].海峡医学，2001，13(3):35-37.

[3]陈雪龙，齐艳萍.四氯化碳急性肝损伤小鼠血清及肝组织学变化[J].中国兽医杂志，2011，47(1):39-41.

[4]周琳，冯俊涛，马志卿，等.雷公藤总生物碱对粘虫的生物活性[J].植物保护学报，2006，33(4):401-406.