激活剂对石油污染土壤修复的强化作用及修复条件的优化

张秀霞，滕 芝，吴佳东，白雪晶

（中国石油大学 环境与安全工程系，山东 青岛266580）

近年来，国内外对石油污染土壤的微生物修复的研究较多。但石油烃类污染物降解速率缓慢，治理时间较长，是这项技术的一个突出缺点［1］。在微生物修复过程中，土著微生物较外来微生物有较高的适应性，且污染物的早期降解主要由土著微生物来实现。基于这一想法，科学家开始尝试采用土著微生物进行生物强化修复石油污染土壤的研究［2－5］。生物刺激是生物修复的重要策略之一，它是通过提供微生物生长所需要的营养元素，或改善微生物生长的环境条件，来刺激土著微生物的生长，以迅速启动修复过程。生物刺激是当前生物修复领域研究的热点［6］。

响应面优化实验方法可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对目标值的影响［7］。在本研究中，通过向石油污染土壤中添加不同作用的激活剂来强化生物修复效果。笔者分析了各激活剂的强化效能，并采用响应面分析法对修复实验进行优化，为修复现场的实验设计和结果表达提供参考。

1 实验部分

1．1 供试土壤

供试土壤为胜华炼油厂原油罐区长期被石油污染的土壤，石油烃含量（质量分数）为5．3%，其基本理化性质列于表1。由表1可以看出，供试土壤的含水率较低［8］，C、N 质量比（mC／mN）为55，氮含量相对较低［9］。实验前土壤样品需经过破碎、除杂、过筛及混匀处理。

表1 供试土壤的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soil sample for test

在本研究中，以土壤样品最初的石油烃质量分数（w0）为基准，测定经过修复后该土壤样品的石油烃质量分数（wt），按式（1）计算石油残留率η。

1．2 石油污染土壤修复的实验过程

由于供试土壤的氮含量相对较低，不利于微生物的代谢活动，需添加氮源来调节mC／mN。

将混合均匀的供试石油污染土壤分装到大小相同的、底部带孔的花盆（每盆1kg）中，加入一定量的葡萄糖、H2O2、木屑和氮源。木屑均匀地撒到土壤中，氮源、葡萄糖用去离子水稀释溶解，与H2O2均用喷雾器均匀地喷洒到土壤中，搅拌均匀，进行修复实验。为了考察所添加葡萄糖、H2O2、木屑和氮源这4种激活剂对土壤修复效果的影响，得到其最佳添加量。修复实验设置处理组和对照组，对照组包括1个样品，不添加任何激活剂；处理组包括12个样品，其中添加不同量的激活剂。各样品所添加激活剂的质量分数和mC／mN值列于表2。

将处理组和对照组样品在30℃恒温箱内培养30d，每天添加相同量的水，保持水的质量分数在16%～20%范围，并搅拌1次，保持较好的通风。第0、7、14、21、30d取样测定相关指标。采用超声波萃取－紫外分光光度法测定土壤的石油烃含量，采用微生物黏着碳烃化合物法测定细菌的表面疏水性。

表2 石油污染土壤修复实验各土样的激活剂用量Table 2 The amounts of activation agents used in strengthening bioremediation experiment of oil contaminated soil

1．3 响应面优化（RSM）设计

1．3．1 RSM因素水平的选取

通过上述对石油污染土壤样品的修复实验，可得到几个因素对石油烃降解影响情况，再根据Box－Behnken的中心组合试验设计原理，在单因素实验的基础上采用RSM方法进行优化实验。

1．3．2 RSM 实验设计方案

以A、B、C为自变量，以石油残留率（η）为响应值，进行17个试验点（5个中心点）的RSM实验，除因素水平的变化外，其实验条件与强化修复一致，第30d取样测土壤中石油残留率η，以确定石油污染土壤生物修复的最佳实验条件。

2 结果与讨论

2．1 激活剂用量对石油污染土壤中石油烃生物降解的影响

在实验的第0、7、14、21、30d取样，测定各实验花盆中石油烃的残留率，结果如图1～图4所示。

图1 mC／mN对石油污染土壤石油烃残留率（η）的影响Fig．1 Influence of mC／mNon oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

图2 葡萄糖用量对石油污染土壤石油烃残留率（η）的影响Fig．2 Influence of glucose on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

图3 H2O2用量对石油污染土壤石油烃残留率（η）的影响Fig．3 Influence of H2O2mass fraction on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

图4 木屑用量对石油污染土壤石油烃残留率（η）的影响Fig．4 Influence of sawdust mass fraction on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

2．1．1 mC／mN的影响

由图1可以看出，改变石油污染土壤的mC／mN可以提高其中石油烃的降解效果。当mC／mN＝25时，石油烃降解效果最好，经过30d，石油残留率仅为42%左右，较对照样提高了约40百分点，效果明显。mC／mN过高会使营养不能满足微生物代谢需要，mC／mN过低，即氮素过多会造成一定的毒害作用，结果都使石油烃降解效果变差。选择mC／mN＝25作为实验的最佳值。

2．1．2 葡萄糖的影响

由图2可以看出，在石油污染土壤中添加一定量的葡萄糖对石油烃的降解有促进作用。葡萄糖不仅可以作为外加碳源，而且还可以作为微生物代谢的中间产物［10］。葡萄糖添加量为0．3%时，石油烃残留率明显降低；随着葡萄糖添加量增加，石油烃残留率反而升高，而且在搅拌过程中，能闻到土样有较明显的酸味，为此，测定了第30d的土壤样品的pH值以及细菌菌液的疏水性，结果列于表3。

表3 石油污染土样添加葡萄糖修复30d的pH值及细菌菌液的疏水性Table 3 pH value of soil sample added glucose and bioremediation repaired for 30dand hydrophobic property of bacteria fluid

由表3可以看出，经30d修复后土壤的pH值随葡萄糖加入量的增加而下降；除添加0．3%葡萄糖土样的菌液疏水性有所提高外，其他2个菌液疏水性均有所下降。较多的葡萄糖使得微生物代谢增加，产生了更多的酸性物质，使土壤的pH值降低，从而抑制了微生物的活性；同时葡萄糖的加入改变了细菌合成的细胞壁的结构特征，使其表面疏水性下降［11］。但是葡萄糖作为营养源又促进了细菌的繁殖，使得石油降解率有所提高。选择适宜的葡萄糖添加量为土壤质量的0．3%。

2．1．3 H2O2的影响

H2O2本身可以氧化石油污染土壤中简单的石油烃化合物，其产生的氧气又可以促进土壤微生物的呼吸，提高其活性［2］。由图3可以看出，添加一定量的H2O2能够降低土壤中石油烃残留率；H2O2添加量为0．5%的土样经30d修复，其石油残留率比对照样少约40%，而且添加量为0．3%和0．5%的2组土样中修复效果相差不大，均比添加量为0．1%的效果好。考虑到既能提高修复效果又要经济实用，选择H2O2的最佳添加量（质量分数）为土样的0．3%。为了探究H2O2的作用机理，将H2O2添加量为0．3%的石油污染土壤培养10d，测定土壤中的脱氢酶活性和石油残留率，结果列于表4。

表4 添加H2O2的石油污染土壤培养10d后的脱氢酶含量和石油残留率（η）Table 4 Dehydrogenase mass fraction and oil residual rateηof oil contaminated soil with H2O2added after 10dbioremediation

由表4可以看出，添加H2O2且未灭菌以及湿热灭菌后添加H2O2的土样修复10d后，石油残留率均比对照样的低，前者脱氢酶含量比对照样增加了50%，可见H2O2本身的氧化作用可以降解一部分烃类物质。另一方面，由于H2O2自身独特的分子结构，可作为电子受体催化微生物脱氢的酶活性［2］，进而提高石油降解率，降低了土壤中石油烃的残留率。

2．1．4 木屑的影响

从图4可以看出，木屑的加入对提高石油污染土壤的石油降解效果也很明显，但不同添加量对修复效果影响的变动较大，以3%的添加量的效果最好；木屑加入量为5%时，可能使土壤的空隙过大，微生物集结于木屑表层，较难达到土壤中与石油污染物接触，所以强化修复效果又变低。表5为添加木屑前后土样中速效磷、蛋白质以及有机质的含量。

表5 添加木屑前后土样中速效磷、蛋白质以及有机质的含量Table 5 The content changes of Available phosphorus，protein and organic matter in soil sample before and after sawdust added

由表5可以看出，添加木屑可以增加土壤的肥力，为微生物提供营养；土壤中的蛋白质、有机质等有机成分的增加，可提高石油与木屑的接触能力，从而使附着于木屑上的细菌更容易与石油接触，增加其降解的机会。实验中同时发现，添加木屑的土样较湿润，这是因为木屑具有较好的保水性，能避免水分的蒸发，维持生物的生长需要。木屑的最佳添加量（质量分数）为3%。

2．2 石油污染土壤生物修复的RSM实验结果

2．2．1 RSM 的因素和水平

由图1～4可以看出，4种激活剂的加入对土壤石油的降解均有一定的促进作用。综合激活剂的强化修复效果，选取对石油降解效果影响最显著的mC／mN、w（H2O2）、w（Sawdust），将它们作为A、B、C3个因素，以＋1、0、－1分别代表变量的水平，采用3因素3水平的响应面分析方法进行优化实验。实验因素与水平设计见表6。

表6 石油污染土壤生物修复响应面优化实验的因素与水平Table 6 Factors and their levels of the response surface methodology for bioremediation of oil contaminated soil

2．2．2 RSM 实验的结果

采用3因素3水平的RSM实验的结果列于表7，得到的响应面分析图形示于图5。

表7 石油污染土壤生物修复得RSM实验的结果Table 7 Experimental results of RSM for bioremediation of oil contaminated soil

图5 石油污染土壤生物修复的RSM分析所得的响应面Fig．5 Response surfaces obtained from RSM analysis for bioremediation of oil contaminated soil

2．2．3 RSM回归方程的建立与分析

利用软件 Design expert 7．0对Box－Behnken试验结果进行二次多项回归拟合，获得石油残留率（η）对土壤mC／mN（A）、w（H2O2）（B）以及w（Sawdust）（C）的多元二次回归方程，如式（2）所示。

式（2）中，η为石油残留率的预测值；A、B、C分别是土壤mC／mN、H2O2和木屑的添加量。

通过对回归方程中的回归系数分析，可以得到该方程的R2＝0．9874。说明该模型拟合良好，可用于预测和分析添加激活剂强化修复石油污染土壤的情况。

对回归方程的分析显示，该模型稳定点为一倒马鞍形顶点，是极小值，从中可获得最佳实验参数，即mC／mN为24．6，H2O2的加入量为0．32%，木屑加入量为2．9%。在此条件下，土壤强化修复30d后，石油残余率的理论值为43．6%。同时，由图5可以看出，二维图的图像接近于椭圆形状，说明影响因子的交互作用显著；由图形的缓陡程度可以看出3个因素对土壤石油降解率影响的显著性，显著性从大到小依次是mC／mN、H2O2的加入量、木屑加入量。

按照上述最优反应条件进行2组平行验证实验，30d取样测定得到的石油残留率为44．2%，与回归模型预测的最优条件下石油残留率43．6%非常接近。由此可见，该模型能较好的预测和分析添加激活剂强化修复石油污染土壤的情况。

3 结 论

向石油污染土壤中适当添加氮源、葡萄糖、H2O2、木屑4种不同作用的激活剂，能起到较好的强化修复作用，以氮源、H2O2、木屑的影响效果最明显。用响应面优化法对实验参数进行优化，得到的回归方程可用于预测和分析添加激活剂强化修复石油污染土壤的情况。

［1］赵晴，张甲耀，陈兰洲，等．疏水性石油烃降解菌细胞表面疏水性及降解特性［J］．环境科学，2005，26（5）：132－136．（ZHAO Qing，ZHANG Jiayao，CHEN Lanzhou，et al． Cell－surface hydrophobicity and degradation characteristics of hydrophobic hydrocarbon degrading bacteria［J］．Environmental Science，2005，26（5）：132－136．）

［2］秦煜民．化学添加剂在石油污染土壤微生物治理过程中的作用［J］．河北理工学院学报，1999，5（21）：52－55．（QIN Yumin．The function of chemicals in the bioremediation on process of petroleum contaminated soil［J］．Jounral of Hebei Institute of Technology，1999，5（21）：52－55．）

［3］MORTAZAVI B，HOREL A，BEAZLEY M J，et al．Intrinsicrates of petroleum hydrocarbon biodegradation in Gulf of Mexico intertidal sandy sediments and its enhancement by organic substrates［J］．Journal of Hazardous Materials，2013，244－245：537－544．

［4］乔俊，陈威，张承东．添加不同营养助剂对石油污染土壤生物修复的影响［J］．环境化学，2010，29（1）：6－11．（QIAO Jun，CHEN Wei，ZHANG Chengdong．Bioremediation of petroleum contaminated soil by various nutrient amendments ［J］．Environmental Chemistry，2010，29（1）：6－11．）

［5］HINO S，WATANABE K，TAKAHASHI N．Isolation and characterization of slime－producing bacteria capable of utilizing petroleum hydrocarbons as a sole carbon source［J］．Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（6）：528－531．

［6］董志涛，吴金伟．石油污染土壤的生物修复研究进展［J］．广州化工，2010，38（6）：32－34．（DONG Zhitao，WU Jinwei．Advances on bioremediation of petroleumcontaminated soil［J］．Guangzhou Chemical Industry，2010，38（6）：32－34．）

［7］张立明，张霞，郑传莉，等．响应曲面法优化三叶青总黄酮提取工艺研究［J］．时珍国医国药，2010，21（10）：2588－2590．

［8］毛丽华，吕华，李子君．石油污染土壤生物强化修复的机制与实施途径［J］．有色金属，2006，58（1）：92－96．（MAO Lihua，LÜ Hua，LI Zijun．Mechanism and methods of bioaugmentation remediation of petroleum hydrocarbon－contaminated soil［J］．Nonferrous Metals，2006，58（1）：92－96．）

［9］樊鹏军，徐建蓉，陈竹云，等．石油污染土壤原位生物修复的强化实验研究［J］．油气田环境保护，2010，20（3）：20－23．（FAN Pengjun，XU Jianrong，CHEN Zhuyun，et al． An experimental research on the intensifying effects of microbial restoration for oilcontaminated soi［J］．Environmental Protection of Oil＆ Gas Fields，2010，20（3）：20－23．）

［10］王蕾，聂麦茜，王志盈，等．外加碳源对优良菌降解芘的影响研究［J］．水处理技术，2009，35（6）：24－27．（WANG Lei，NIE Maiqian，WANG Zhiying，et al．Influence of exotic carbon source on pyrene biodegradation by predominant strains［J］．Technology of Water Treatment，2009，35（6）：24－27．）

［11］李海春，王红武．胞外表面活性物质在石油烃生物降解过程中的形成及其作用［J］．四川建材，2010，36（2）：70－71．（LI Haichun，WANG Hongwu．Formation and effect of extracellular surface－active substances in the biodegradation of petroleum hydrocarbons［J］．Sichuan Bulding Materials，2010，36（2）：70－71．）