揭秘化妆品安全性评价技术（八）

　　
　　
　　化妆品中存在许多光感性物质，如含有共轭结构的防晒剂、指甲油和唇膏的某些着色剂、用于化妆品中的杀菌剂三氧N-碳酸苯胺、三氯生，含香豆素类的某些植物提取物（如甘菊环烃、六-甲基香豆素、贯叶金丝桃提取物、茉莉、肉桂、葵子麝香），以及药物和某些功能性化妆品（特殊用途化妆品）原料如氯丙嗪、盐酸氯丙嗪氟喹诺酮、噻嗪、酚噻嗪、磺胺、喹啉、苯酮等。这些物质通过接触、口服、注射等途径进入体内，与一定照射剂量的光线或紫外线接触后诱发的不良反应均可称之为光毒性效应，具体可包括皮肤毒性反应、迟发性免疫反应、光遗传毒性和光致癌性等。
　　各国化妆品法规均规定，能吸收紫外线的化妆品成分和化妆品成分的混合物（用于紫外线过滤剂的化学物，例如用于确保化妆品的光稳定性或用于防晒产品中）应进行急性光毒性和潜在光遗传毒性测试。对于潜在光致敏性和光遗传毒性的测试不作特别要求，但这类试验也常进行。
　　一、光毒性效应及临床表现
　　紫外线是由原子的最外层电子从高能级向低能级跃迁时以光形式释放的能量，根据波长范围分为UVA(315nm～400nm)、UVB(280nm～315nm)和UVC?(100nm～280nm)，不同波长的紫外线产生不同的生物学效应。紫外线的主要作用是激发或催化物质产生化学作用，除用于杀菌外，过量的紫外线照射诱发皮肤光毒性效应。临床表现主要有以下几种：
　　1、光毒性皮炎：指化妆品中某些物质能增强皮肤对光的敏感性，日光照射激活此类物质对皮肤产生刺激作用而导致皮肤损伤，与免疫无关。指甲油和唇膏中常用的着色剂，如荧光素和曙红为光敏剂。煤焦油和沥青等物质中含有强光敏性物质蒽、甲基蒽及荧蒽等，当UV照射到吸收了这些物质的皮肤时，可与皮肤发生光毒性炎症反应。长期职业接触煤焦油和沥青可形成职业性黑变病。
　　2、光变应性接触性皮炎：是接触光变应原物质后，在暴露于光线的部位出现的皮肤炎症反应，而在不接触光的部位则不出现这种反应。该变应性反应属于T细胞介导的湿疹样反应，表现以湿疹为特征，在暴露部位出现小疱疹和发展为大疱疹，并伴有脱屑、结痂，慢性阶段可出现苔癣样皮肤增厚。例如皮肤接触含有对羟基甲酸及其酯类物质等变应原的防晒化妆品，只要一次接触日光即可发生此类皮炎并持续1周左右。葵子麝香是重要的光变应原，皮肤使用含该香料的化妆品可引发光变应性皮炎，甚至可发展为持久性光敏反应。接触含煤焦油染料的化妆品可引起光变应性皮炎，后期可出现色素沉着，也称之为“色素性化妆品皮炎”。常见的光致敏原还有磺胺类药物、吩噻嗪、香豆素、苯胺、香皂和除臭剂中的杀菌剂三氧N-碳酸苯胺、防晒剂中的对氨基苯甲酸衍生物。
　　3、职业性色素加深：过度接触紫外线、日光、红外线、煤焦油及其衍生物、橡胶改良剂和防老化剂，无机砷、碳素及某些染料，或从事避孕药及氯丙嗪生产等，均有可能引起皮肤色素增多。波长越短，透入皮肤的深度越小，照射后黑色素沉着较弱，波长越长，透入皮肤的深度越大，照射后黑色素沉着较强。紫外线作用于黑色素细胞，引起黑色素在细胞内从底部向表面转移重新分布，造成皮肤色素增加。在UV下照射5min内，皮肤可暂时性变黑，称为晒斑反应，主要由长波紫外线UVA引起的。
　　4、皮肤癌：紫外线是皮肤的主要致癌因素，鳞状细胞癌和表皮基底细胞癌通常与慢性或过量的UV暴露相关。部分化学物质也能诱发皮肤癌，如多环芳烃和无机砷等还参与UV致癌作用的调控。
　　二、光毒性的体内实验
　　光敏物质的共同特点是能吸收300~750?nm波长范围的光线，吸收光能量后被激活而成为活跃状态。按照光化学第一定律，只有吸收足够的光量子才能发生光化学反应。因此测定被测物质的UV/可见光吸收光谱是任何体外或体内生物系统测试光敏特性的前提。具体测定方法可参考OECD试验指南101和国家GB/T9721-2006《化学试剂分子吸收分光光度法（紫外可见光部分）》。如果摩尔消光/吸收系数小于10L/mol-1 cm-1，则该化学物质光吸收低，不可能具有光反应性。不必进行任何其它测定光化学效应的生物学试验，包括急性光毒性体内和体外试验。
　　1、人体光斑贴试验
　　人体光斑贴试验是通过在人体皮肤表面直接敷贴受试物，并同时接受一定剂量适当波长紫外线照射的方法，检测诱发光毒性与光变应性皮炎的光敏剂以及检测机体对某些光敏剂反应的一种皮肤试验。方法和一般斑贴试验一样，首先将被检物贴敷在患者背部或前臂屈侧，同时照射UVB和UVA，测定其最小红斑量（MED）。24～48h后以3/4MED的光线照射贴敷物的一半，再过48h观察结果，如果仅在贴敷物+照射部位发红，水肿或发生小丘疹（有时发生小水疱）时为阳性反应，被检物质即是光感物质。
　　2、光毒性动物实验
　　将一定量受试物涂抹在动物去毛的背部皮肤上，经一定时间间隔后暴露于UVA光线下，观察受试动物皮肤反应并确定该受试物有否光毒性。单纯涂受试物而未经照射区域未出现皮肤反应，而涂受试物后经照射的区域出现皮肤反应分值之和为2或2以上的动物数为1只或1只以上时，判为受试物具有光毒性。
　　
　　三、急性光毒性的体外替代方法
　　传统的皮肤光毒性试验以动物试验为主，上世纪80年代以来，光毒性的体外替代试验得到发较快的发展，急性光毒性效应已找到完全替代动物试验的方法。目前经过验证的光毒性的试验方法共三项，分别是体外3T3光毒性中性红摄取试验（3T3-NRU-PT）、红细胞光毒性试验（RBC-PT）和重建人体皮肤模型光毒性试验（H3D-PT），后两种方法是3T3-NRU-PT有效和重要的辅助方法，能弥补3T3-NRUPT的某些不足。其它未经验证的方法是酵母试验的光鸡胚试验。3T3-NRU-PT是这三种方法中的核心测试法，是目前国际标准和法规要求的光毒性测试的唯一方法，但在我国还未获得监管部门的认可。当某一化学物的潜在光毒性不能由3T3-NRU-PT法获得足够的信息时，还可以用另外两种体外方法RBC-PT和H3D-PT。
　　1、3T3成纤维细胞中性红摄取光毒性试验（3T3 NRU-PT）
　　
　　本试验方法建立的基础是比较有或无非细胞毒性剂量的刺激性光照射情况下化学物的细胞毒性。细胞毒性是以受试物在光照射处理24h后，与受试物浓度相关的细胞摄取活体染料中性红的还原量来表示的。加有不同浓度受试物的3T3细胞在96孔板中孵育1h。然后，暴露在紫外线/可见光（有效UVA剂量为1.67mW/cm2）50min，24h后测试中性红在540nm处的光密度值。同时，加有相同化学物的第二块板放在暗处做对照板。通过剂量－反应曲线的非线性拟合模型计算使细胞活性抑制50%的受试物浓度（IC50）。结果分析可采用两种计算模型。一种是光刺激因子（PIF），定义为测得的无UVA照射和有UVA照射时IC50值的比，另一种是平均光效应（MPE），即比较化学物在有UV光和无UV光时获得的剂量－反应曲线下面积，通过数学分析导出数值。如果PIF<2或MPE<0.1时，预测“无光毒性”；如果25或MPE>0.15时，预测“有光毒性”。
　　德国Battelle实验室最早用人的类皮肤细胞进行体外光细胞毒性试验，后来，Beiersdorf（德国汉堡）实验室用开发了Balb/c 小鼠成纤维细胞3T3 NRU-PT光毒性试验方法。ZEBET的统计学家开发了PIF预测模型，汉堡大学的Holzhütter等开发了MPE预测模型。借助数据处理和分析软件可提高检测的标准化和效率。3T3-NRU-PT试验于2004年正式作为指南TG 432发布，并被EMEA（欧洲药品管理局）、美国FDA和日本政府认可作为监管用途。2008年中国将其转化为国家标准（GB/T21769-2008）并用于化学品光毒性检测。
　　2、联合血红细胞光毒性测试（RBC-PT）
　　光溶血是一种简单快速的筛选光敏感物质的体外技术，结合血红蛋白氧化可在人体细胞水平上筛选光敏物和研究光毒性作用机制。目前标准化的RBC-PT方法测定红细胞的两个终点，即光溶血和甲基化-血红蛋白（met-Hb）形成，包括光溶血和血红蛋白光氧化两个试验。实验中将化学物质与红细胞接触，暴露于光线一段时间，在525 nm处测定吸光度评价光溶血作用，630nm处测定吸光度评价met-Hb的形成。预测模型为两个判定值，通过检测光溶血因子（PHF）和最大吸光度值来确定化学物质的光毒性。PHF≥3.0判定为光溶血阳性，最大吸光度值(delta)ODmax≥0.05 判定为met-Hb形成阳性。
　　验证研究认为，RBC-PT测试与体内试验终点具有良好的一致性，并提供两种不同类型的光动力学反应机制的信息（甲基化血红蛋白形成表明I型反应，光红细胞溶血效应是原发性的II型反应）。用红细胞的另一个优点是其对太阳光的短波UVB有耐受性，使PBC-PT测试能较长时间地暴露于高剂量的UVB下，以充分获得光毒性机理的信息。RBC-PT试验已完成COLIPA/ ECVAM的双盲测试条件下的预验证和验证，有待被认可为急性光毒性体外测试的标准方法。目前RBC-PT已用于欧洲（德国）、日本的一些实验室，中国质检和部分从事体外检测的实验室也开展此项检测。
　　3、人体三维皮肤模型的体外光毒性测试（H3D-PT）
　　三维重建皮肤模型不仅可替代动物实验用于皮肤刺激性的检测，还可用于体外测试替代光毒性动物实验。3D皮肤模型可从商业途径获得或实验室自制，前提是只有严格质量控制和标准化达到一定程度的模型才能用于体外毒性试验。以EpiSkinTM皮肤模型为例，该模型由成人角质细胞经体外培养分化形成多层人体表皮结构。完整的检测试剂盒包含12个表皮单位、必须培养基和无菌培养板。先将含EpiSkin皮肤的培养置于培养箱中备用。一块板用于无光照条件下的不同浓度的待测化学品的测试（类似人工皮肤模型的皮肤刺激试验），另一板用于有光照条件下的不同浓度的待测化学品的测试。2h后去除受试物，用无细胞毒性剂量的光线照射2h。最后进行细胞活性测定（MTT法）和IL-1α的测定。如果导致细胞毒性增加25%以上或者IL-1α释放量之差≥40 pg/ml，则这个化学物就被预测为具有光毒性，如果一个化学物即没有引起细胞毒性增加25%，也没有引起 IL1>40pg就被预测为无光毒性。
　　H3D-PT法的优点在于由于重建皮肤具有代谢活性，因3A7XlTo7wG3X3U5QrMb9uQ==而可以对受试化学物质的生物利用度进行评价。但是对于那些不能通过局部途径进入皮肤、但通过系统途径（例如口服或注射暴露）在皮肤具有足够生物利用度的光毒性物质不能检测，也不能检测需要重复暴露后才能造成光变态反应的弱光反应化学物。H3D-PT试验不能作为评估化学物光毒性的独立方法，但可作为3T3-NRU-PT试验的补充方法。
　　4、未验证的替代方法
　　酵母试验（yeast assay）：哺乳动物细胞和细菌对于长时间的紫外线特别是UVB暴露过于敏感，限制了其在光毒性和光遗传毒性试验中的应用。厌氧啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种真核生物，具有对太阳光暴露或水溶性化学物长时间暴露相对不敏感的优点，不管水溶性受试物是油状还是膏体状，甚至是氧压极低的情况（如油状或奶油状）都可以检测。与哺乳动物细胞和其它试验生物相比，利用啤酒酵母检测化学品的光毒性相对简单和经济，可以快速进行定量和定性检测。厌氧酵母增殖试验是基于化学物质与细胞、器官或DNA的光动力学反应，通过比较光照和非光照条件下，检测与化学物质接触24h后的细胞增殖率或克隆形成能力来评价光照下化学物质对细胞生长的影响。
　　光鸡胚试验（photo hen’s egg t