人乳头瘤病毒基因型与宫颈病变关系的研究

周世媛 薄立伟 王艳丽 牛成玲 谢建生 柴 健

1.河南省人口和计划生育科研院(郑州，450000);2.深圳市妇幼保健院

·临床研究·

人乳头瘤病毒基因型与宫颈病变关系的研究

周世媛1薄立伟1王艳丽1牛成玲1谢建生2，*柴 健1

1.河南省人口和计划生育科研院(郑州，450000);2.深圳市妇幼保健院

目的:了解人乳头瘤病毒(HPV)感染基因型分布，探讨不同HPV基因型感染与宫颈病变的关系。方法:收集门诊就诊者宫颈脱落细胞行液基薄层细胞检测并按照TBS分类标准进行细胞学诊断，同时应用低密度基因芯片技术进行HPV检测和基因型分析(15种高危基因型、5种低危基因型和Cp8304基因)。结果:862例标本中，共检出19种HPV基因型。宫颈细胞学正常(NILM)组前3位HPV基因型是HPV 11、6和42，HPV单一与多重感染分别占75.86%和24.14%;细胞学异常组居前3位的HPV基因型是HPV 16、52和58，HPV单一与多重感染分别占71.11%和28.89%，该组以高危型HPV感染为主(88.71%)。细胞学正常组和异常组HPV感染率分别是11.28%和64.66%(χ2=299.33，P＜0.05)。随宫颈病变级别递增，HPV感染率呈增高趋势。结论:不同的HPV基因型具有不同的致病力，HPV多重感染与宫颈病变的发生、发展密切相关，HPV感染率随宫颈病变程度增加而增加。

人乳头瘤病毒 基因分型 宫颈病变

人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起子宫颈癌和宫颈上皮细胞病变的主要病因。目前全世界已发现的120余种HPV基因型中，约有40种涉及生殖道感染，20余种与肿瘤有关［1］。根据宫颈癌发生的危险因素，将HPV分为高危型和低危型两大类。长期持续高危型HPV感染可以诱发宫颈癌及癌前病变，低危型HPV可以导致生殖器尖锐湿疣、疱疹等疾病［2］。感染不同型HPV，其预后结果、诊治、预防的标准不尽相同，因此检测高危型和低危型HPV具有重要临床价值。本文应用低密度基因芯片技术对临床标本进行HPV检测并分析基因型分布，探讨HPV基因型与子宫颈病变的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

随机选取2008年7月～2011年8月来本院妇科门诊就诊的有性生活史、非月经期妇女862例，年龄35.2±5.6岁。用采样刷收集宫颈脱落细胞，用液基薄层细胞检测技术(TCT)检测宫颈细胞后，将剩余标本置于－20℃保存，用于HPV DNA检测。按照TBS分类标准，将标本分为5组:正常及炎症或良性反应性改变(NILM)视为细胞学正常组共514例;意义不明确的不典型鳞状细胞(ASC－US)以上级别视为细胞学异常组共348例，其中ASCUS 196例，低度鳞状上皮内病变(LSIL)96例，高度上皮内病变(HSIL)54例，鳞状细胞癌(SCC)2例。

1.2 研究方法

1.2.1 TCT检测将保存液中的标本经 Thin Prep2000系统处理后，制成直径2cm薄层细胞涂片，95%乙醇固定，HE染色，镜检。按照TBS分类标准进行细胞学诊断。

1.2.2 HPV DNA检测取保存液中脱落细胞标本1.5ml，15 000r/min离心 10min，按照文献［3］方法提取DNA。应用低密度基因芯片技术进行HPV检测和基因型分析，包含HPV15种高危基因型、5种低危基因型和Cp8304基因型。检测系统中的PCR扩增，基因芯片杂交，洗膜及底物显色的实验步骤，结果判读见文献［4］。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0统计学软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 HPV基因型分布和感染状况

在862例标本中，共检出19种HPV基因型。在正常组514例标本中检出HPV阳性58例，基因型14种，HPV基因数73个，前3位基因型依次是HPV11(17.81%)、HPV6(16.44%)、HPV42(9.59%)。其中低危型HPV占43.84%(32/73)，高危型占50.68%(37/73);HPV单一感染占75.86%(44/58)，多重感染占 24.14%(14/58)，其中二重、三重感染分别占22.41%(13/58)和1.72%(1/58)，并且以HPV11结合其它HPV基因型的多重感染最多见，占20.69%(6/29)，高危型多重感染率为48.28%(14/29)。异常组348例标本检测出HPV 225例，HPV基因型19种，HPV基因数310个，居前3位基因型依次是 HPV16(21.61%)、HPV52(12.58%)、HPV58(10.97%)。构成比 ＜1%的基因型是HPV39(0.97%)和HPV51(0.65%)，其中低危型HPV占8.71%(27/310)，高危型占88.71%(275/310)。HPV单一感染占71.11%(160/225)，多重感染占28.89%(65/225)，其中二、三、四重及以上感染分别占21.33%(48/225)、6.22%(14/225)和 1.33%(3/225)。在多重感染中以 HPV16结合其它基因型最为常见，占16%(24/150)，高危型多重感染率为82%(123/150)。异常组高于正常组高危型多重感染率(χ2=13.57，P＜0.05)。见表1。

表1 两组对象感染HPV基因型分布情况(例)

HPV基因 正常组(n=514)单一感染 多重感染 构成比(%)异常组(n=348)单一感染 多重感染 构成比(%)52 2 1 4.11 22 17 12.58 53 2 1 4.11 5 7 3.87 56 0 0 0.00 1 4 1.61 58 3 2 6.85 18 16 10.97 59 0 0 0.00 2 3 1.61 66 0 0 0.00 6 8 4.52 68 1 2 4.11 5 8 4.19低危型11 7 6 17.81 1 14 4.84 6 7 5 16.44 0 8 2.58 42 4 3 9.59 2 2 1.29其它Cp8304 3 1 5.48 5 3 2.58合计44 29 100 160 150 100

2.2 HPV感染与子宫颈病变的关系

在862例标本中，HPV感染率是32.83%(283/862)，正常组和异常组感染率分别是11.28%(58/514)和64.66%(225/348)，两组相比其差异有统计学意义(χ2=299.33 ，P＜0.05)。NILM、ASC － US、LSIL、HSIL和SCC 5组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。组间两两比较，NILM 与 ASC－US组，ASC－US与LSIL组，LSIL与HSIL+SCC组差异均有统计学意义( χ2=141.08，P＜0.05; χ2=9.25，P＜0.05;χ2=4.34，P＜ 0.05)。HPV 感染率随宫颈病变级别升高，呈增高趋势，见表2。

表2 细胞学检查结果与HPV感染的关系

3 讨论

宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤第2位，其中80%发生在发展中国家［5］。HPV已被普遍认为是引起宫颈癌及其癌前病变的主要原因，99.7%的宫颈癌患者被发现有HPV感染，而HPV感染的基因型及感染持续时间与宫颈癌的发生、发展及预后密切相关［6］。

生殖道HPV感染非常普遍，在女性一生中，生殖道HPV感染的几率＞75%，且多数HPV感染能自然清除［7］，但高危型HPV的持续感染会增加宫颈癌前病变及宫颈癌的发生，且不同的HPV基因型具有不同的致病力。因此，HPV基因型检测是诊断和处理宫颈病变的重要依据。在所有HPV基因型中，目前已明确有15个型与宫颈癌相关，属于高危型，包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。但仍有一些HPV基因型因感染率较低，其致癌的危险性有待于进一步的研究。在世界范围内HPV16是引发宫颈癌的最主要的基因型，其次多数地区是HPV18。除这两个基因型外，其他HPV基因型的分布存在明显的地区差异［8］。在本研究中，细胞学异常组HPV感染率为64.66%，高危型HPV感染占88.71%，低危型占8.71%。最常见的基因型是 HPV16(21.61%)，其次为 HPV52(12.58%)，第3位是 HPV58(10.97%)，而 HPV18感染率则较低，仅占5.81%。这与我国和亚洲其他地区的研究结果相一致，只是各型感染率略有不同［9］。在细胞学正常组中，HPV感染率为11.28%，低危型和高危型HPV基因型分别为43.84% 和50.68%，常见的HPV感染基因型是 HPV11、6、42和16。说明即使宫颈细胞没有异常情况下，HPV感染以低危型为主，高危型发病趋势依然存在。提示对有性生活史的妇女即使无宫颈细胞学异常改变，HPV筛查及基因分型检测也不容忽视。

女性生殖道HPV感染存在基因型单一感染与多重感染。有学者认为在宫颈癌的发生过程中HPV基因型多重感染比单一感染危险度高，且多重感染患者出现持续感染的危险性更大，而HPV持续感染是宫颈病变发生的主要原因［10］。本研究中，细胞学异常组与正常组HPV基因型多重感染分别为28.89%和24.14%，其中最多见的基因型在异常组是HPV16(16%)，正常组是HPV11(20.69%)，两组均以二重感染为主(21.33%，22.41%)，这与Hwang等［11］研究结果相似。而两组的高危基因型多重感染率分别为82%和48.28%，存在差异，说明HPV基因型多重感染与宫颈病变的发生、发展密切相关。而对于高危型HPV多重感染是否能加速宫颈病变的进展，高危型与低危型 HPV混合感染时，对宫颈病变的发展是否会起到一定的剂量－效应协同作用，还都有待进一步研究。

宫颈病变是一种常见的妇科疾病，其发生与多种因素有关，宫颈部位如果感染了特定基因型的HPV将会增加其病变发展为宫颈癌的风险［12］。本研究发现，随着宫颈病变程度的不断增加，HPV的感染率亦伴随着增加。从细胞学正常组11.28%到异常组64.66% ，显著升高，而发展至宫颈鳞状上皮癌，HPV感染率则达100%;且组间两两比较，NILM与ASC－US组、ASC－US与LSIL组、LSIL与HSIL+SCC组均有统计学差异，说明HPV感染与宫颈病变程度增加呈正向关系，提示HPV感染与宫颈癌前病变及宫颈癌的发生发展密切相关。同时本研究中还发现，细胞学异常组出现的高危 HPV39、51、56、59、66基因型，在正常组没有发现;高危基因型除HPV35、53、68外，其它HPV基因型出现率均高于正常组，而在正常组中常见的低危HPV11、6、42基因型和Cp8304，在细胞学异常组则明显较低。提示一些HPV基因型出现在宫颈细胞学异常人群中较多，而在正常人群中出现较少或不出现，有可能是引发高度宫颈病变或有较高的致癌性HPV;而出现在宫颈细胞学正常人群中较多，在宫颈细胞异常人群中出现较少或不出现的基因型有可能不致癌，进一步提示各HPV基因型对宫颈上皮致病力不同。这些结论的证实还有待进一步扩大样本量并对HPV感染人群进行跟踪随访，了解HPV基因型的转归和发展。如果此结论成立，就可以了解本地区引发宫颈癌及癌前病变的高危HPV基因型和低危HPV基因型，帮助医务人员根据患者所感染的HPV基因型，预见宫颈病变的发展，并对是否需要治疗、治疗后情况进行评估。

持续、高危型HPV感染是宫颈癌发生首要条件，从HPV感染癌前病变到宫颈癌的发生一般需要数年到十几年，如果在此阶段对HPV感染的基因型进行早期筛查、早期诊断、及时治疗，就可以极大程度地防止子宫颈癌的发生。

1 田永强，朱中元.以PCR为基础的HPV检测及其在宫颈癌筛查和治疗中的价值［J］.中国热带医学，2008，8(3):419 －422.

2 Dell.G，Gaston K.Human papillomavirus and their role in cervical cancer［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58(12 －13):1923 －1942.

3 Gravitt PE，Peyton CL，Alessi TQ，et al.Improved amplification of genital of genital human papillomaviruses［J］.J C M，2000，38(1):357－361.

4 周世媛，朱爱荣，薄立伟，等.低密度基因芯片检测人乳头瘤病毒基因型的研究［J］.中国计划生育学杂志，2012，20(5):342－345.

5 乔有林.子宫颈癌筛查方法新进展［J］.医学研究杂志，2009，38(11):3－11.

6 Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide［J］.J Pathol，1999，189(1):12 －19.

7 Bouvard V，Baan R，Straif K，et al.A review of human carcinogens－Part B:biological agents.Lancet Oncol，2009，10(4):321 － 322.

8 Wu Y，Chen Y，Li L，et al.Assisciations of high－resk HPV types and viral load with cervical cancer in China［J］.J Clin Virol，2006，35:264－269.

9 黄谷孙，林奕华，叶珊.宫颈炎患者人乳头瘤病毒基因分型的研究［J］.中国预防医学杂志，2008，9(3):189－192.

10 Ho GY，Bierman R，Beardsley L，et al.Natural history of cervico vaginal papillomavirus infection in young women［J］.N Engl J Med，1998，338:423 －428.

11 Hwang HS，Park M，Lee SY，et al.Distribution and prevalence of human papillomavirus genotypes in routine pap smear of 2470 Korea women determined by DNA Chip［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13(12):2153 －2156.

12 Stoler MH.Human papillomaviruses and cervical neoplasia:a model for carcinogenesis.Int J Gynecol Pathol，2000，19:16 － 28.

The study of relationship between human papillomavirus genotypes and cervical epithelial lesions

Zhou Shiyuan1，Bo Liwei1，Wang Yanli1，Niu chengling1，Xie Jiansheng2，*，Chai Jian1
1.Henan Research Institute for Population＆Family Planning，Zhengzhou450000;2.Shenzhen Maternity＆Infant Health Hospital

*Corresponding author:Xie Jiansheng，Email:jinshengxie2000@yahoo.com.cn

Objective:To investigate the cervical condition and genotypes of human papillomavirus(HPV)infection and explore the relationship between different genotypes of HPV infections and cervical epithelial lesions.Methods:Cervical exfoliated cells were collected from 862 outpatients and examined by thin－cytologic test，and the cervical cytological conditions were evaluated by The Bethesda System(TBS)as negative for intraepithelial lesion or malignancy((NILM)or different degrees of lesions.Low－density gene chip－based detection system for HPV genotypes(15 types of high－risk HPVs，5 types of lowrisk HPVs and CP8304)was employed to detect the HPV infections.Result:19 of 21 HPV genotypes were detected in 862 specimens.The most common HPV genotypes were HPV11，6，42 and 16 in NILM group，and HPV16，52 and 58 in cervical lesion group.The detection rate of HPVs in NILM and lesion group were 11.28%and 64.66%，respectively.The constituent ratios of single and multiple infections of HPV genotypes were 75.86%and 24.14%in NILM group，and 71.11%and 28.89%in lesion group，respectively.The high －risk HPV genotypes were the most prevalent HPV infections(88.71%)in lesion group.The distribution of different HPV genotypes varied with the different degrees of cervical lesions.Conclusion:There was a close relationship between the multiple infection of HPV genotypes and the development of cervical epithelial lesions.Infection of HPV(s)increased with the grade of cervical lesions.

Human papillomavirus;Genotype;Cervical lesion

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.11

河南省科技攻关计划项目

2012－06－06

*通讯作者:jianshengxie2000@yahoo.com.cn

［责任编辑:张 璐］