不同乙醇预处理方式对LMD 分离牙胚组织总RNA 完整度的影响*

党 平 聂敏媛 董 亮 崔三哲 汤楚华 史 亮 郑翰圣 董 蕊 施生根

了解特异组织的特征基因表达谱被认为是未来再生医学成功修复中老年患者靶器官的关键步骤之一[1]。而近十年来，基因芯片等高通量手段对上述研究起到了极大的推动作用，被广泛应用于各种组织和细胞的基因特异表达谱研究[2]。但如果被研究细胞量少，或位于组织深部而受混杂细胞所干扰，目标细胞的特征基因表达往往会被其他无关组织基因表达的“噪声”所掩盖。激光显微切割(Laser m icrodissection，LMD)能让研究者从三维异质性组织中精确分离相对单一细胞群并提取其中核酸进行分析[3,4]。但制约该技术应用的问题之一即是激光切割过程可能对样品总RNA完整度带来的影响[5]，RNA的降解甚至会影响到对后续基因表达结果的解读[6,7]。

影响组织RNA降解的RNA酶分为外源性和内源性，实验准备阶段的用品和实验环境的准备是为了尽量消除外源性RNA酶的影响；而内源性酶的作用则与亲水环境关系密切。另外环境中过大湿度会影响激光切割效率，因此以乙醇预处理切割前的组织切片不失为一种简便易行的方法。既往文献曾有过用乙醇配置染色溶液和以不同乙醇条件预处理组织切片的报道[8,9]。

本研究比较以两种方式乙醇预处理未经染色的冰冻组织切片，考察其对后续提取小鼠牙胚组织样品总RNA完整度的影响。

1.材料和方法

1.1试剂和仪器 异戊烷(sigma，美国)，100%无水乙醇(Merck KGaA，德国)，OCT冷冻包埋剂(Shandon，英国)，无RNase水(Invitrogen，美国)，RNaseAWAY(Invitrogen，美国)，LMD6000显微切割系统(Leica，德国)，2100生物分析仪(Agilent，美国)。

1.2实验动物及实验用品准备 实验动物为CD1小鼠，实验所用时期分别为胚胎期17天(E17)、和生后2天(PN2)。孕期的确定：前一天下午或晚上合笼，第二天早上检查发现阴栓，当天即记为E0天。实验动物购自韩国Koatech生物公司，实验在韩国延世大学牙科学院解剖发育学教研室完成。

因实验涉及RNA提取步骤，而RNA酶无处不在，所以必须在整个操作过程中避免产生新的RNase污染。加样枪头、EP管等耗材尽量使用一次性新开封的，玻璃器皿应在配置好的0.1%DEPC水进行8-12h的浸泡，经高压灭菌使DEPC灭活，再进行几个小时的烘干，方可使用。

1.3取材 以锋利剪刀快速切取小鼠下颌组织，在DEPC-PBS中漂洗去血液，投入1.5m l装有异戊烷的离心管内，将装有组织的离心管放入液氮盒内，约6-8s，见到组织发白即可取出，冷冻时间不宜过长。倒出组织块后，迅速将其置入有OCT冷冻包埋剂的包埋模具内，迅速调整组织块包埋位置，再放回液氮盒中冷冻，注意勿使液氮液面高于组织块，取材全过程应使包埋组织块受保护于液氮中。

1.4冰冻切片 先以40um进行粗切，待牙胚大致形态出现后，再换用20-25μm细切两层。此时可以刀片修包埋块形态，使OCT边缘紧贴组织即可。可在光镜下选样，待找到需要的形态结构后，准备好LMD覆膜切片，开始收集。

1.5两种乙醇预处理步骤 待以覆膜切片集齐所需组织切片后，第一种方式采用直接以100%无水乙醇预处理覆膜组织切片5-10s后晾干；第二种方式为以70%，80%，90%，100%乙醇各5-10s梯度脱水后晾干。须注意的是两种方式均应待OCT包埋剂稍干燥后再以乙醇预处理，观察到表面干燥后再存放入冰切机机箱。对照组为未经乙醇预处理的无预处理LMD组。

1.6 Leica LMD6000激光显微切割操作流程

(1)按顺序打开显微操作平台、激光发生器、软件计算机的电源。

(2)打开Leica显微切割操作软件。

(3)设置软件操作参数：放大倍数为10x-20x；线条为连续，封闭；切割精度为精确切割；切割时间为选择后切割。

(4)将切片放置于载片架上，将0.2m l PCR管放置于持管架上，管盖内加入30μL细胞裂解液。

(5)选定目标组织或细胞群，点击开始切割，附有选定的目标细胞群PEM 膜即会落入下方管盖内的细胞裂解缓冲液中。

1.7组织RNA的抽提 以美国Ambion公司RNA queousM icro Kit抽提试剂盒提取组织RNA，操作按试剂盒说明书进行。

1.8 RNA样品质量控制 以美国安捷伦公司2100生物分析仪的RNA 6000微流芯片对组织RNA 样品进行质量控制，用其提供的核糖体RNA 28s/18s比值(28s/18sRatio)、RNA完整度数值(RNA Integrity Number，RIN)，以及样品电泳图的图形来综合判断样品完整度。

1.9数据统计分析 利用SPSS16.0软件包对无预处理切割组、100%乙醇处理组组与梯度乙醇处理组之间样品RNA完整度RIN值，28s/18s Ratio均数及标准差进行统计分析，多组之间的差异使用方差分析，组间两两比较使用Student-Newman-Keuls test检验。

2.结果

不同乙醇预处理方式对提取样品RNA完整度的影响。

本实验意在明确不同乙醇处理方式是否可以提高LMD过程中样品抗降解能力。结果显示100%乙醇直接预处理组，RIN值最高且与另两组相比差异有显著性，梯度乙醇处理组RIN值与无预处理LMD组相比，并无显著性差异(见附表、图1、图2)。以28s/18sRatio值为指标，100%乙醇预处理组高于其它两组，但差异并无显著性；梯度乙醇处理组与无预处理LMD组间差异亦无统计学意义。

附表 不同乙醇预处理对提取样品RNA完整度(RIN值、28s/18sRatio，±s)的影响

附表 不同乙醇预处理对提取样品RNA完整度(RIN值、28s/18sRatio，±s)的影响

注：100%乙醇处理组RIN 值高于其余两组，且两差异均有显著性，*p＜0.05。

样品 Ratio(28s/18s) RIN无预处理LMD 组梯度乙醇处理组100%乙醇处理组7.0±0.78 7.2±0.36 8.3±0.49*1.75±0.48 1.78±0.63 1.91±0.71

图1 无预处理LMD组、梯度乙醇处理组、100%乙醇处理组三组样品RNA电泳图(峰值模式)

图1电泳峰值模式图显示梯度乙醇处理组与无预处理组RNA样品18S峰值高于28S，而100%乙醇预处理组则相反。图2电泳迁移模式图显示各组样品18S、28S条带清晰，而100%乙醇预处理组28S亮度比18s亮度更高。

图2 无预处理LMD组、梯度乙醇处理组、100%乙醇处理组三组样品RNA电泳图(迁移模式)

3.讨论

再生医学的成功实施有赖于对拟修复器官在特定情况下特异基因表达的充分了解，对该分子网络的了解有助于我们人工形成促进该组织再生的微环境。而激光显微切割(Laserm icrodissection，LMD)技术是近几年兴起的用于精确分离目标组织或细胞的高新技术，它能在显微镜高倍视野下观察到特异性组织和细胞，再利用激光束对目标组织/细胞进行切割分离，这对于解决“细胞/组织异质性”问题发挥了重要作用。

LMD对组织切片的要求：(1)保持足够的组织成分完整度，以供下游实验分析；(2)形态学辨认清楚，保证目标组织被精确识别。

针对第一点，如仅需提取组织中的蛋白质，则长期保存的石蜡切片也有可能获得成功。但如果所需提取的是样品中最易降解的RNA，则冰冻切片无疑是首选的取材方式。而为了实现保护组织，有研究者甚至动用了在LMD系统上加装真空或惰性气体保护取材区的复杂方式[9]。如果没有这些非常规手段，只有结合所使用切割系统的特点，综合设计，优化整个取材流程，目的就是——减少目标组织在落入裂解液前的非保护状态下的暴露时间，一般文献建议在15-20m in内完成LMD切割[7,9]。如以本次实验切割早期矿化的牙胚组织为例，配合LMD6000切割系统的单人操作样品数以三枚样品为一组较为适宜。在冰冻切片完成后，立即转入LMD切割，三枚样品分离完毕，立即收集裂解液，冻存于-70度冰箱保存。

针对第二点，如果组织的形态学鉴别非常困难，一般通过染色的方式加以克服。但由于常规的染色过程处于亲水状态，在较长时间的染色过程中易造成RNase对细胞RNA的降解。如果经费充裕又追求切割时形态辨认的绝对精确性，可以购买价格不菲的专用染色试剂盒产品，据厂家宣传可以保持染色及切割过程中RNA完整性。也有学者使用自制的以乙醇为溶剂的染色剂，来尽量避免接触亲水过程[11]。在本研究中的前期实验中，作者首先设计实验明确了常规染色对样品完整性的破坏，即使以DEPC水配制染色剂，以期尽可能消除染料中的RNase，染色过程依然会对样品的完整性造成较大破坏；再经过反复多次染色练习，熟悉光镜下组织结构，基本实现了在镜下无需染色直接观察区分牙囊结构。对于难以区分的样品，一般做舍弃处理或仅染色普通光镜切片以辅助识别，节约了染色步骤所需时间和避免了亲水环境对组织的降解。研究认为内源性RNA酶的作用离不开细胞内的亲水环境，因此本实验比较了两种乙醇处理方式：100%乙醇处理和梯度乙醇脱水对于保护激光切割前组织RNA的完整度的差异，结果显示前者更具优势。推测可能与该步骤简单节约操作时间以及整个步骤未再创造亲水环境从而抑制了细胞内源性RNA酶的作用有关。

完整和均一是评价RNA质量的最关键标准，也是下游生物学分析尤其是基因组学研究的基础和保障。最为常用的RNA完整度鉴定方法是琼脂糖凝胶电泳，但其缺点是对RNA用量要求较高，至少200ng以上，因而无法检测微量RNA。从显微切割而来RNA的特点就是量非常少而宝贵，目前较为先进的方法还是以安捷伦公司的生物分析仪2100为首选，能够分析ng级的RNA[12]。文献上多数以其自带的RIN值为讨论依据，一般为大于7.0至8.0为标准，辅以rRNA的28s/18s的比值，以1.8-2.0附近为佳，过高或过低都不好。另外还需依据电泳图波形，即peak pattern来判断是否有基因组DNA残留。本研究结果提示，分析样品降解程度应综合上述三项指标，尤其是样本量较小的时候，单一指标可能并不能充分反应样品降解程度。

[1] 唐 旭，王素云，刘 琪.工程化基质在牙周组织再生中的临床应用[J].中华老年口腔医学杂志，2007，5(3)：185-188

[2] Duggan DJ,Bittner M,Chen Y,et al.Expression profiling using cDNA m icroarrays[J].Nat.Genet，1999，21：10-14

[3] Jacquet R,Hillyer J,Landis WJ.Analysis of connective tissues by laser capture m icrodissection and reverse transcriptase-polymerase chain reaction[J].Anal Biochem，2005，337(1)：22-34

[4] Kai N,Iw ase K,Imai K，et al.A ltered gene expression in the subdivisions of the amygdala of Fyn-deficient m ice as revealed by laser capturem icrodissection and m KIAA cDNA array analysis[J].Brain Res，2006，1073，1074：60-70

[5] W ang-XiaW ang,Bernard R.W ilfred,Donald A.Baldw in et al. Focus on RNA isolation: Obtaining RNA for m icroRNA(m iRNA)expression profiling analyses of neural tissue[J].Bioch im ica et Biophysica Acta，2008，1779(11)：749-757

[6] Fleige S,Pfaffl M.W.RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance[J].Mol Aspects Med，2006，27：126-139

[7] Copois V,Bibeau F,Bascoul-Mollevi C,et al.Im pact of RNA degradation on gene expression profiles:Assessment of different methods to reliab ly determ ine RNA quality[J].Biotechnol2007，127:549-559

[8] W ang S,W ang L,Zhu T,et al.Im provem ent of tissue preparation for laser capturem icrodissection:application for cell type-specific m iRNA expression profiling in colorectal tumors[J].BMCGenom ics，2010，11：163

[9] Clement-Ziza M,Munnich A,Lyonnet S,et al.Stabilization of RNA during laser capturem icrodissection by perform ing experim ents under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions[J].Rna，2008，14(12)：2698-2704

[10]W ang WZ,Oeschger FM,Lee S,et al.H igh quality RNA from m ultiple brain regions sim ultaneously acquired by laser cap turem icrodissection[J].BMCMol Biol，2009,10：69

[11]W ang H,Ow ens JD,Shih JH,et al.H istological staining methods preparatory to laser capture m icrodissection significantly affect the integrity of the cellular RNA[J].BMC Genom ics，2006，7：97

[12]W eis S,Llenos IC,Dulay JR,et al.Quality control form icroarray analysis of human brain sam ples:The im pact of postmortem factors,RNA characteristics,and histopathology[J].JNeurosciMethods，2007，165(2)：198-209