CO/HO-2 体系在胎兔动脉导管组织中的表达

向招燕，李涛，余明华，李亚

动脉导管未闭( patent ductus arteriosus，PDA) 是常见的先天性心脏病之一，大约占先天性心脏病的7% ～10%［1］。在足月儿中，其发病率为1/2000，男女比例为1:2［2］; 早产儿动脉导管未闭的发生率较足月儿高，可达20%左右［3］;且胎龄和体重越小，发病率越高［4］。PDA 若未及时治疗，常可诱发和促进慢性肺疾病、颅内出血、心力衰竭等疾病，是影响早产儿致残率和死亡率的重要因素之一。但到目前为止，动脉导管未闭的机制尚不十分明确。有研究显示其与遗传、缺氧、离子通道( 氧敏感性钾通道) 、血管活性物质( 前列腺素、内皮素、血栓素) 等因素有关［5-7］。近年来，我们课题组研究表明气体网络分子系统［一氧化氮( NO) 、一氧化碳( CO) 、硫化氢( H2S) ］中的NO 和H2S 存在于动脉导管组织中，并且在PDA 的发病机制中起到一定的作用［8］;亦有研究表明CO 在心血管系统中的功能与NO 相似，可以舒张血管，降低血管对收缩介质的反应。NO 在动脉导管的舒张与收缩中发挥着作用，所以我们推测如果动脉导管中存在CO 的表达，那么可能CO 也在动脉导管的舒张与收缩中发挥着与NO 相似的功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物 胎龄30 d 的日本大耳白兔孕兔( 由湖北医药学院实验动物中心提供) ，体重2.5 ～5 kg，实验动物许可证号:SYXK( 鄂)2011-0031。

1. 2 主要试剂 Trizol 试剂( Life Technologies，美国) ;逆转录试剂盒( Fermentas，美国) ;2* Taq PCR MasterMix( 天根生化科技，北京) ; 荧光定量PCR 试剂盒( Fermentas，美国) ;DL 1000 DNA Marker( TaKa-Ra，大连) ;实时荧光定量PCR 引物序列:HO-2 引物序列上游引物: 5＇-AGC AGC ATA GTA GGG GCA TTT-3＇下游引物:5＇-ACC TGA ACC TGA AGA CCA AAG A-3＇，GAPDH 引物序列上游引物:5＇-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3＇ 下游引物: 5＇-GGT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3＇，引物均由上海生工生物工程;RIPA 裂解液( 强) ( Beyotime，上海) ;BCA 蛋白质定量试剂盒( 天根生化科技，北京) ; 一抗兔抗兔HO-2( abcam，美国) ; 内参小鼠抗兔B-actin( Beyotime，上海) ;二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔( 鼎国，北京) ;Prestained Protein ladder( Fermentas，美国) ;内源性一氧化碳试剂盒( 南京建成) ; 其余试剂为国产市售分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 4 只孕龄为30 d 的的日本大耳白兔，共产下24 只足月的仔兔( 平均每只产仔6 只) ，产下的仔兔立即固定于工作台上，在无菌的条件下，分别取出仔兔动脉导管组织(－80℃保存) 和新鲜心脏血，做好标记，备用。

1.3.2 仔兔动脉导管组织中HO-2 mRNA 表达水平的检测 TRIzol 法抽提动脉导管中HO-2 mRNA，BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪检测所提mRNA的浓度及纯度( 总RNA OD260/OD280 均介于1.7 ～2.0 之间说明提取的总RNA 质量纯，这也保证后面荧光定量PCR 实验的可靠性及可重复性) ，两步法逆转录成cDNA 后进行RT-PCR 和实时荧光定量PCR 法检测。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。RT-PCR 反应体系( 25μl 体系) : 按天根生化科技提供的步骤程序进行操作，并设内参对照( 内参引物为GADPH) 。扩增条件: 按天根生化科技提供的步骤程序进行操作，退火温度58℃，其他条件不变。在Biometra Tpersonal 型扩增仪上扩增，Touching 凝胶系统上分析结果。SYBR 荧光定量PCR 反应体系(25μl 体系) :qPCR Master Mix(2X)12.5μL，Water nuclease-free10.5μL，cDNA1μL，上游引物0.5 μL，下游引物0. 5μL，并设内参对照( 内参引物为GADPH) 。扩增条件:按Fermentas 公司提供的程序进行操作，退火温度58℃，其他条件不变。在ABI Prism 7500 型荧光定量PCR 仪上进行扩增并分析实验结果。

1.3.3 仔兔动脉导管组织HO-2 蛋白表达水平的检测 提取蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度，计算蛋白上样量，SDS-PAGE 电泳分离( 浓缩胶恒压100 V，1 h;分离胶恒压120 V，3 h) 、转膜( PVDF 膜，恒压18 V，2 h) ，室温封闭1 h，分别依次加入一抗兔抗兔HO-2抗体(1:1000) ，内参小鼠抗兔β-actin 抗体(1:800) ，4℃缓慢摇动孵育过夜，振洗后加入二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(1:5000) ;室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。振洗完，显色后SYNGENE上分析结果。

1.3.4 胎兔血浆一氧化碳含量测定 按照南京建成生物工程所有限公司提供的实验步骤操作，最后带入公式计算。计算公式为:

Hb( g/L) =540nm 处吸光度值× 367. 7; Hb-CO% =〔0.822 ×△OD( A568－A581) +0.001〕×100%; 全血中CO 含量( μmol/L) = HbCO% × Hb( g/L) ×106 ×4/64456

1.4 统计学分析 采用SPSS 15.0 统计软件进行分析，结果以均数±标准差(±s) 表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仔兔动脉导管组织中HO-2 mRNA 和蛋白表达水平 如图1 所示: 各条带清晰，无二聚体，说明仔兔动脉导管组织中存在HO-2 mRNA 的表达。如图2 所示:仔兔动脉导管组织中H0-2 蛋白的表达呈阳性，从蛋白水平再次证实动脉导管中存在HO-2 蛋白的表达。

图1 动脉导管组织中HO-mRNA 凝胶电泳图( 各条带清晰可见，无二聚体，说明引物设计良好，1-4 条带是HO-2 的表达，大小为182bp;5-8 条带是内参GAPDH，大小为112bp，M 条带为DNA Marker)

图2 HO-2 的western blot 图谱( 上面的条带是内参β-action，大小是42kD;下面的条带为HO-2 蛋白的图谱，大小是36kD)

2.2 仔兔动脉导管组织中HO-2 mRNA 表达水平的实时荧光定量PCR 的结果 最终基因表达量用2-ΔΔCt 值表示，其中ΔΔCt =( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 实验组-( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 空白组，其表达量为0.33 ±0.11。

2.3 胎兔血浆一氧化碳含量测定结果 胎兔心脏全血中内源性CO 的含量为53.09 ±6.73( μmol/L) 。

3 讨论

CO 既往被认为是有毒的气体，但近年来，大量研究证实CO 与NO 相类似，即可以舒张血管，降低血管对收缩介质的反应。目前为止，发现体内CO的来源中有两条途径，一条途径是吸入的气体中含有少量CO( 外源性CO) ;另一条途径是体内生成的CO( 内源性CO) 。内源性CO 的产生至少有2 个途径，大部分是在血红素的代谢过程中产生的，即HO催化血红素生成胆绿素、CO、Fe3+; 少量是通过微粒体脂质的过氧化产生，但对其作用机制尚不清楚。研究表明CO 对大鼠主动脉、肺动脉、尾动脉、冠状动脉以及犬的股动脉、颈动脉、冠状动脉等都可以直接调节血管平滑肌细胞的舒缩状态。Johnson 等［9］通过测定脉管扩张流量和脉压发现CO 减弱脉管系统的扩张流量。HO 为内源性CO 产生的限速酶，目前为止已经证明HO 具有三种形式的同工酶:HO-1，HO-2，HO-3。HO-1 不仅对金属，而且对引起氧化应激和其它病理条件的所有刺激和化合物都十分敏感，Polizio 等［10］在果糖诱导的高血压大鼠模型中发现HO-1 在器官抗氧化防御酶系统活性完好的情况下能发挥降低血压作用。Zhu 等［11］通过试验研究发现，CBS/H2S 和HO-1/CO 系统在心肌缺血再灌注中起协同保护作用。Ito 等［12］在转基因小鼠模型中发现诱导HO-1 可增加IL-10 的产生而降低肺动脉高压。Vera 等［13］发现HO-1 降低血管紧张素Ⅱ诱导的高血压，并且减少超氧化物的产生。Coceani 等［14］采用免疫组织化学的方法对羊羔的动脉导管进行研究，发现血红素加氧酶-1 在内皮细胞及平滑肌细胞上都有表达，而血红素加氧酶-2 只在平滑肌细胞表达。近年研究显示，肺血管平滑肌细胞和内皮细胞均有HO 蛋白及其活性的表达，是内源性CO 生成和释放的重要场所之一。

动脉导管是一种特殊的血管，在出生后随着肺呼吸、循环的建立，血氧张力提高，机体内前列腺素迅速降解、缓激肽释放等各种因素作用，促使动脉导管关闭，而在这些因素中前列腺素E2( PGE2) 对维持动脉开放的作用最为重要［15］。Chang 等［16］对小鼠研究表明出生后前列腺素E2对动脉导管的关闭与否起着关键作用。我们课题组发现内源性H2S( 内源性气体分子网络中的一种) 不仅在大血管中能生成，而且在未出生的动物的动脉导管组织中也能产生，在动脉导管组织中有胱硫醚-γ-裂解酶基因表达。大量研究表明CO 在心血管系统中发挥着重要的作用，与NO 类似，CO 也可以激活，升高胞浆中cGMP 水平，进而舒张血管。本研究证实了动脉导管中存在CO/HO-2，这为动脉导管的舒张与收缩机制的研究扩宽了领域。如果进一步的研究能证明CO在动脉导管的开放与关闭机制中发挥着作用，那么CO 是通过什么途径舒张动脉导管的，这些内容还有待进一步的研究。

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