原发性肝癌组织中螺杆菌感染状况分析

杨吉利 季尚玮 张永贵 李红艳 王江滨 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

目前认为原发性肝癌最常见的病因为HBV和HCV感染，其次还与黄曲霉素、酒精、自身免疫等因素有关。但是尽管存在同样的致癌因素，其临床表现及预后也相差甚远。因此，除与上述致癌因素的致病强度及宿主免疫状况等因素密切相关外，是否还存在其他协同致病因素，如细菌感染等，一直是人们关注的焦点。自1982年Warren和Marshall首次发现幽门螺杆菌(H.pylori，Hp)以来，临床及实验研究已证实Hp感染与多种胃肠外疾病密切相关〔1～6〕。国外学者在人类慢性肝病患者的肝组织及胆管组织中均发现了螺杆菌菌属DNA，证实了螺杆菌参与人类肝胆系统疾病的发生〔7，8〕。本实验室也先后在慢性肝病组织中扩增出螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因〔9〕。本文旨在进一步探讨螺杆菌与原发性肝癌的关系及螺杆菌在人类肝癌中的发病机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选择2008年1月至2011年10月吉林大学中日联谊医院及吉林省肿瘤医院手术切除及肝穿刺活检确诊为原发性肝癌的患者36例，男29例，女7例，年龄36～79〔平均(59±13.2)〕岁。按病因分类，合并病毒性感染27例 ，合并酒精性肝炎5例，病因不明肝癌4例。对照组为同期住院的性别和年龄相匹配的肝脏外伤患者29例，所有患者除外慢性病毒性肝炎、肝硬化、嗜酒、药物及自身免疫性疾病及代谢性疾病等因素。两组病例半年内均未接受过抗生素治疗。

1.2 肝组织取材 4块肝组织均来自彩超引导下肝脏穿刺活检或手术切除所得，其中1块-80℃低温保存，用于螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因扩增;2块置于10%甲醛液中固定，用于病理组织学检查;1块保存于含30%甘油及5%小牛血清的布氏肉汤中-80℃保存，行螺杆菌的分离培养及鉴定。

1.3 肝癌组织螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因检测

1.3.1 肝脏组织DNA提取 肝脏组织DNA提取采用3S柱式提取法。试剂盒由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3.2 PCR扩增 PCR反应总体系为 50 μl，包括 Taq DNA聚合酶 2.5 U(0.5 μl)，10 × Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2，3.6 μl(终浓度为 1.8 mmol/L)，10 mmol/L dNTPs 1 μl(终浓度为 200 μmol/L)，25 μmol/L 引 物 各 1 μl(终 浓 度 分 别 为0.5 mmol/L)，DNA模板1 μl。螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因引物序列及PCR反应条件见表1。

表1 螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因引物序列及PCR反应条件

1.3.3 电泳分析 分别取螺杆菌菌属特异性16 S rRNA基因PCR扩增产物10 μl加入2 μl溴酚蓝混合均匀，点样于含0.2%溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中，100 V直流电电泳30 min，然后紫外灯下观察结果，并应用紫外成像系统照相。

1.4 统计学方法 样本均数的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验和Fisher精确检验。应用SPSS11.0软件完成。

2 结果

2.1 原发性肝癌患者肝组织中螺杆菌菌属16S rRNA基因分析 对36例原发性肝癌患者的肝组织DNA采用螺杆菌16S rRNA基因通用引物进行巢式 PCR扩增。结果有 23例(63.9%)肝癌患者的肝组织检测到螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因，而正常肝组织中仅3例(10.3%)为阳性。两组比较有显著差异(χ2=19.18，P＜0.001)。见图1。

图1 原发性肝癌组织与正常肝组织中螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因扩增电泳图

2.2 原发性肝癌组织中螺杆菌感染状况与肝脏基础疾病的相关性分析 为探讨螺杆菌感染与原发性肝癌基础疾病的关系，将肝癌组分为合并病毒性肝炎组、合并酒精性肝炎组、其他组。结果显示：在27例合并病毒感染者中，螺杆菌特异性16S rRNA基因阳性者17例(62.9%);在5例合并酒精性肝炎患者中，螺杆菌16S rRNA基因阳性者4例(80.0%);其他原因者2例(50.0%)。各组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 肝癌组织螺杆菌的分离培养及鉴定 为了证实原发性肝癌患者的肝组织中是否有活体螺杆菌菌体的存在，将36例原发性肝癌患者的肝组织进行螺杆菌分离培养3～10 d，结果均未发现可疑菌落生长。

3 讨论

1992年Fox等〔10〕发现H.hepaticus与 A/J Cr小鼠的慢性肝损伤，甚至肝癌的发生发展有着密切关系。其后，生物学界开始展开了关于螺杆菌属与人类慢性肝病之间关系的研究。随着对螺杆菌菌属研究的不断深入，科学家们相继在人类原发性肝癌组织、丙型肝炎、肝硬化肝组织及胆管癌组织和胆汁中发现了螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因。Pellicano等〔7〕对23例HCV相关性肝癌患者和6例胃肠道恶性肿瘤肝转移患者的肝脏组织进行螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因检测，结果显示23例肝癌组织中有17例(85%)发现螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因，而6例肝转移癌组织中仅有2例发现螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因。Rocha等〔8〕对109例丙型肝炎后肝硬化患者的肝组织进行螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因检测，发现伴有肝癌组、不伴肝癌的肝硬化组螺杆菌16S rRNA基因阳性率分别为68.0%、61.3%，而单纯慢性肝炎组和对照组螺杆菌16S rRNA基因阳性率分别为4.2%、3.5%。提示螺杆菌感染可导致脏脏结构变化，可能是HCV相关性慢性肝病的协同危险因素〔11〕。日本学者通过血清抗H.hepaticus抗体检测提示，在乙肝、丙肝、肝硬化患者中H.hepaticus感染率明显高于健康人群〔6〕。还有学者在胆石症患者的胆汁中检测肝螺杆菌阳性率41%，在胆囊炎合并胃癌的患者中肝螺杆菌阳性率36%，明显高于无胆道疾病的患者〔12〕。本实验室也先后在慢性病毒性肝炎、肝硬化患者的肝组织中扩增出螺杆菌菌属特异性16S rRNA基因。

本结果提示螺杆菌在原发性肝癌的发生、发展过程中扮演重要角色，肝炎病毒、酒精等伴随因素并不是影响螺杆菌感染肝癌患者的主要因素。综上所述，本研究表明螺杆菌感染可能是原发性肝癌重要生物学因素之一。但具体菌种尚需进一步鉴定，而且关于肝螺杆菌诱发肝细胞癌的发生机制还不太清楚，这些均有待进一步研究。

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