Se胁迫条件下EDDS对彩叶草生长和生理指标及Se含量的影响

袁菊红

(江西财经大学艺术学院园林系，江西南昌330032)

近年来，随着工农业和社会经济的迅速发展，大量重金属通过大气沉降、地表径流、垃圾转移等途径进入土壤、河流、湖泊和海洋等生态系统，对生态环境产生危害。重金属是一种难以控制的污染物，具有来源广、毒性大、潜伏期长等特点，且能沿食物链富集和放大，因此，较低浓度的重金属污染便可能损害自然生态系统和人体健康［1］。有效减少和修复重金属污染，缓解其对人体、生物和生态环境的危害，是当今生态环境研究领域面临的难题之一［2］。

硒(Se)是人、动物和微生物的必需营养元素，也是植物生长发育的有益元素，一些地方性流行病(如克山病、大骨节病、动物白肌病和水肿病等)的发生均与人体中Se摄入量低有关［3］，Se还能预防和抑制镉、砷、汞、银等有毒元素对机体的伤害［4-5］;但如果Se吸收过量，会导致人中毒，引起胃肠功能紊乱。此外，Se对大气、水体和土壤也会造成一定的污染。如美国西南地区的Se污染较严重，土壤和水体中Se含量很高，导致鱼类和水禽畸变和死亡［6］;加拿大安大略湖、墨西哥奇瓦瓦地区和波兰托伦市也都因Se污染引起土壤、地表水和水生生物中的Se含量严重超标［7］。中国土壤总体缺 Se，但湖北恩施［8］和陕西紫阳［9］为典型的富Se地区，因Se污染中毒的案例时有发生，例如恩施鱼塘坝人群Se中毒的爆发性流行［10-11］。目前，Se污染已对人类健康和环境安全产生严重威胁，国外学者在Se富集植物的调查、生态毒理以及Se污染的植物修复方面做了大量的研究工作［12-13］，但国内研究者在此领域的研究尚处于起步阶段，相关研究报道较少［14］。

目前，螯合诱导技术已成为重金属污染环境修复的热点，有关螯合剂乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)［15］、二 乙 烯 三 胺 五 乙 酸(diethylene triamine pentacetate acid，DTPA)［16］和氨三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)［17］等诱导植物吸收重金属的研究已有大量报道，但这些螯合剂在环境中非常稳定且不易降解，具有较长的残留效应，同时还对地下水及周边环境造成二次污染。因此，选择适宜的螯合剂是诱导植物修复技术成功的关键。近年来，EDTA的一种可生物降解的结构异构体乙二胺二琥珀酸(［S，S］-ethylenediamine disuccinic acid，EDDS)已成为螯合诱导技术研究的热点并被广泛应用于重金属污染修复［18-20］。

彩叶草(Coleus blumei Benth.)也称五彩苏、五色草、锦紫苏，为唇形科(Lamiaceae)鞘蕊花属(Coleus Lour.)多年生草本植物，原产爪哇岛，广泛分布于非洲和亚洲，其耐热、耐寒，并对光照有较强的适应性，是一种喜湿的旱生植物。彩叶草不仅能去除富营养化水体中的氮和磷等营养盐［21］、抑制水体中藻类的繁殖［22］，还对重金属镉、铝污染等具有良好的耐受性、吸收性和累积性［23-24］。但彩叶草对Se的吸收能力尚不明确。

鉴于此，作者采用室内水培法研究不同浓度生物可降解螯合剂EDDS对1.0 mg·L-1Se胁迫条件下彩叶草生长和生理指标以及Se含量、Se富集系数和转运系数的影响，以期为Se污染植物修复过程中彩叶草及EDDS的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试彩叶草扦插苗购自江西南昌花鸟市场。将彩叶草幼苗从土壤中拔出，用自来水洗净根系上的土壤(尽量不损伤根系)后，用自来水预培养15 d左右，换用1/2Hoagland营养液培养2周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 处理方法 实验于2011年10月20日至11月15日在江西财经大学生态环境实验中心进行。按赵兰枝等［25］的配方配制基础完全营养液，组成成分包括 3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2、4.0 mmol·L-1KNO3、1.0 mmol·L-1KH2PO4、1.0 mmol·L-1MgSO4、3.6×10-3mmol·L-1MnCl2、4.5×10-2mmol·L-1H2BO3、8×10-4mmol·L-1CuCl2、1.5×10-3mmol·L-1ZnCl2、1.4×10-5mmol·L-1(NH4)6Mo7O24和 9.0×10-2mmol·L-1Fe-EDTANa2。选取茎粗和株高基本一致、生长健壮、无病虫害且叶片颜色基本一致的彩叶草幼苗，定植于7孔PVC板(孔径32 mm)上，每孔定植4株〔总质量约(25±2)g〕，然后置于盛有5 L基础完全营养液的塑料桶中培养。培养10 d(即10月30日)后更换基础完全营养液，并进行EDDS和Se胁迫处理。EDDS 共设置6 个处理水平:0.0(对照，CK)、0.5、1.0、1.5、2.5 和5.0 mmol·L-1，将 EDDS 直接加入基础完全营养液中;Se质量浓度为 1.0 mg·L-1，以Na2SeO3形式直接加入上述6种处理液中。每处理28株，各重复4次，即每处理总株数为112株，随机排列，在自然温度和光照条件下培养，并监测实验期间的温度变化。每隔5 d更换1次处理液，共更换3次处理液，培养期间进行连续曝气。处理15 d(即11月15日)后采样进行各项指标测定。

1.2.2 生理指标测定方法 分别采集各处理组所有彩叶草植株的根和不同部位叶片，洗净后混合，直接用于各项生理指标的测定。采用硫代巴比妥酸法［26］测定根系中丙二醛(MDA)含量;采用考马斯亮蓝G-250染色法［27］测定叶片中可溶性蛋白质(Pro)含量;采用氯化硝基氮蓝四唑光化还原法［28］测定叶片中超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用愈创木酚比色法［28］测定叶片中过氧化物酶(POD)活性;采用紫外分光光度法［29］测定叶片中过氧化氢酶(CAT)活性;采用Nakano等［30］的方法测定叶片中抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性;采用邱睿等［31］的方法测定叶片中还原型谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽过氧化酶(GSHPx)活性。

1.2.3 不同器官鲜质量及Se含量的测定方法 用不锈钢剪刀将彩叶草的根、茎、叶分离，用自来水冲洗干净后，用去离子水冲洗多次并用滤纸吸干表面水分，用BS224S型千分之一电子天平(德国赛多利斯公司)称量鲜质量。将各器官样品于75℃烘干至恒质量，研磨成粉后用于Se含量测定。Se含量测定参照陈思杨等［32］的方法，样品粉末用HNO3-HClO4进行消化，采用电感耦合等离子发射光谱法(ICP-AES)测定Se含量，待测样品送至浙江大学污染环境修复与生态健康教育部重点实验室进行分析。

1.3 数据统计及分析

参照段曼莉等［33］的方法、根据不同器官的Se含量计算彩叶草中Se的富集系数和转运系数。地上部富集系数 BCF=C地上部分/C处理液=(C茎+C叶)/C处理液;转运系数 TF=C地上部分/C地下部分=(C茎+C叶)/C根。式中，C表示不同部位或器官中的Se含量;因处理液中添加1.0 mg·L-1Se，C处理液即为1.0 mg·kg-1。

应用Excel 2003和SPSS 17.0统计分析软件对实验数据进行统计和方差分析并作图。

2 结果和分析

2.1 EDDS对Se胁迫条件下彩叶草鲜质量的影响

实验期间，室内温度基本保持在11℃ ～21℃之间，完全适宜彩叶草的正常生长。从彩叶草的整体生长情况来看:实验前期室内光照充足，植株叶色鲜艳;但实验后期高浓度EDDS处理组彩叶草的叶色明显变黄甚至枯萎。

从培养15 d后各处理组彩叶草不同器官的鲜质量(表1)可见:在1.0 mg·L-1Se胁迫条件下，添加0.5 ～1.5 mmol·L-1EDDS 可促进彩叶草的生长，而添加2.5和5.0 mmol·L-1EDDS则抑制彩叶草生长。添加 0.5 mmol·L-1EDDS，彩叶草根、茎、叶的鲜质量均显著高于对照(P＜0.05)，分别比对照高47.9%、13.5%和16.5%。随着处理液中EDDS浓度的提高，彩叶草根、茎和叶的鲜质量均持续下降;在添加2.5和5.0 mmol·L-1EDDS的条件下，彩叶草各器官的鲜质量均小于对照但差异较小。

表1 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草不同器官鲜质量的影响(±SE)1)Table 1 Effect of EDDS with different concentrations on fresh weight of different organs of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

表1 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草不同器官鲜质量的影响(±SE)1)Table 1 Effect of EDDS with different concentrations on fresh weight of different organs of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

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2.2 EDDS对Se胁迫条件下彩叶草一些生理指标的影响

在1.0 mg·L-1Se胁迫条件下添加不同浓度EDDS对彩叶草根系MDA含量及叶片中一些生理指标的影响分别见表2和表3。

表2 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草根系MDA 含量的影响(±SE)1)Table 2 Effect of EDDS with different concentrations on MDA content in root of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

表2 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草根系MDA 含量的影响(±SE)1)Table 2 Effect of EDDS with different concentrations on MDA content in root of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

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由表2可见:在Se胁迫条件下，添加不同浓度EDDS可显著降低彩叶草根系中的MDA含量，从而缓解或降低Se胁迫对彩叶草的毒害。随EDDS浓度的提高，MDA含量逐渐增加但均显著低于对照;在添加0.5、1.0 和 1.5 mmol·L-1EDDS 的条件下，MDA 含量增加幅度很小且3个处理组间差异不显著，而在添加2.5 和5.0 mmol·L-1EDDS 的条件下，MDA 含量显著高于低浓度处理组。

由表3可见:在 Se胁迫条件下，添加0.0～5.0 mmol·L-1EDDS，彩叶草叶片中 SOD、CAT和APX活性均随着EDDS浓度的提高呈现先降低后升高的变化趋势。在添加1.0 mmol·L-1EDDS的条件下，这3种酶的活性降到最低值，分别比对照降低了32.5%、35.5%和 66.2%，差异显著(P＜0.05);在添加 5.0 mmol·L-1EDDS的条件下，SOD和CAT活性高于对照，而APX活性则低于对照。

在 Se胁迫条件下，添加 0.0 ～5.0 mmol·L-1EDDS，彩叶草叶片的GSH含量以及POD和GSHPx活性变化均呈现先上升后下降的趋势。在添加1.0 mmol·L-1EDDS条件下，彩叶草叶片中GSH含量最高且显著高于对照，增幅达42.1%;在添加1.5～5.0 mmol·L-1EDDS的条件下，随 EDDS浓度的提高，叶片中GSH含量明显降低，但均高于对照。在添加1.0 mmol·L-1EDDS的条件下，彩叶草叶片中POD和GSH-Px活性均达到最高值，不仅显著高于对照也显著高于其他EDDS处理组(P＜0.05)。

2.3 EDDS对Se胁迫条件下彩叶草体内Se含量及Se富集和转运系数的影响

在1.0 mg·L-1Se胁迫条件下添加不同浓度EDDS，彩叶草不同器官的Se含量及其富集和转运系数见表4。

由表4可以看出:在Se胁迫条件下，添加0.5～5.0 mmol·L-1EDDS 后，彩叶草根、茎、叶各器官中的Se含量以及地上部Se富集系数和转运系数的变化趋势基本一致，均随EDDS浓度提高呈先升后降的趋势。在低浓度(0.0 ～1.0 mmol·L-1)EDDS 条件下，各器官中的 Se含量明显增加，其中1.0 mmol·L-1EDDS处理组根、茎、叶中的Se含量最高，分别为对照的1.6、3.4 和 3.5 倍;在 1.5 ～5.0 mmol·L-1EDDS条件下，随EDDS浓度提高，各器官中的Se含量逐渐减少，但均较对照高，其中在添加5.0 mmol·L-1EDDS条件下各器官Se含量仅略高于对照且无显著差异。从不同器官的比较看，彩叶草根中的Se含量均极明显高于叶和茎，茎中的Se含量则略高于叶但二者差异不大。

表3 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草叶片中一些生理指标的影响(±SE)1)Table 3 Effect of EDDS with different concentrations on some physiological indexes in leaf of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

表3 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草叶片中一些生理指标的影响(±SE)1)Table 3 Effect of EDDS with different concentrations on some physiological indexes in leaf of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

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在Se胁迫条件下，添加 0.5和 1.0 mmol·L-1EDDS，彩叶草地上部Se富集系数急剧增大且均显著高于对照，其中1.0 mmol·L-1EDDS处理组Se富集系数最大，达38.0，说明在1.0 mg·L-1Se胁迫下添加1.0 mmol·L-1EDDS可明显诱导彩叶草对Se的吸收和富集作用;而在添加 1.5～5.0 mmol·L-1EDDS条件下，Se富集系数逐渐减小但仍高于对照，而其中5.0 mmol·L-1EDDS处理组的Se富集系数在各处理组中最小但略高于对照。

在添加不同浓度EDDS的条件下，彩叶草体内的Se转运系数变化也较大，其变化趋势与彩叶草对Se的富集系数的变化趋势一致，但各处理组的转运系数均显著高于对照，其中1.0 mmol·L-1EDDS处理组的转运系数最大，5.0 mmol·L-1EDDS处理组的转运系数最小。

表4 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草不同器官Se含量和富集系数及转运系数的影响(±SE)1)Table 4 Effect of EDDS with different concentrations on Se content in different organs and enrichment coefficient and translocation coefficient of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

表4 不同浓度EDDS对1.0 mg·L－1Se胁迫条件下彩叶草不同器官Se含量和富集系数及转运系数的影响(±SE)1)Table 4 Effect of EDDS with different concentrations on Se content in different organs and enrichment coefficient and translocation coefficient of Coleus blumei Benth.under 1.0 mg·L－1Se stress(±SE)1)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

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3 讨 论

3.1 EDDS对Se胁迫条件下彩叶草生长及Se富集能力的影响效应

通过与土壤溶液中的重金属离子结合，螯合剂可以改变重金属元素在土壤中的存在形态，使重金属元素从土壤颗粒表面解吸出来，由不溶态转化为可溶态，从而使土壤中的重金属活化，为土壤中重金属的淋洗或植物吸收创造有利条件。目前，使用螯合剂诱导植物修复重金属污染土壤已成为植物修复的研究热点之一。然而，使用螯合剂可能影响作物的生长，包括叶面部分坏死、叶片萎蔫和断裂、茎部干裂、蒸腾作用减弱和生物量降低等［34-35］。本研究结果表明:Se胁迫条件下，外源EDDS浓度低于1.0 mmol·L-1时，彩叶草根中MDA含量较对照显著降低，但根、茎和叶的鲜质量却较对照显著增加，说明在此浓度范围内EDDS可以减轻Se对彩叶草细胞膜脂的过氧化伤害，有利于促进彩叶草的生长。该结果与Esringü等［36］对球芽甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera Zenk.)的研究结果一致，但熊国焕等［37］的研究结果表明:螯合剂EDDS对大叶井口边草〔Pteris cretica var.nervosa(Thunb.)Ching et S.H.Wu〕生物量没有明显影响。这些研究结果的差异可能与供试植物种类、重金属元素种类、处理时间、实验方式及条件以及螯合剂浓度等存在差异有关，而且这种差异究竟是与EDDS有关还是与重金属富集有关尚待进一步研究。

适宜的螯合剂可以增加土壤中重金属的溶解性，从而促进植物地上部对重金属的吸收和积累。富集系数(BCF)和转运系数(TF)可用于表征不同植物富集和转运污染物的能力。BCF值越高表明植物对某种污染物的富集能力越强;TF值越高则代表植物将根系吸收的污染物转运到地上部分的能力越强，越有利于污染环境的植物修复［38］。作者的研究结果表明:在1.0 mg·L-1Se胁迫条件下，添加低浓度EDDS可明显增加彩叶草根、茎和叶中的Se含量，其中，添加1.0 mmol·L-1EDDS，彩叶草各器官中Se含量均为对照的1.6倍以上，且BCF和TF均达到最大。说明在Se胁迫条件下添加适宜浓度的EDDS有利于彩叶草对Se的吸收和富集。

3.2 EDDS对Se胁迫条件下彩叶草抗氧化系统的影响

正常情况下，植物体内的活性氧代谢处于平衡状态，使细胞免受伤害;而在胁迫条件下，植物体内产生活性氧自由基的速率超过植物清除活性氧的能力，引起过氧化伤害。SOD、CAT和POD是植物适应多种逆境胁迫的重要酶，也是植物抗氧化系统的重要组成部分。APX是植物膜脂过氧化酶促防御体系中重要的保护酶之一，还是ASA-GSH氧化还原途径的重要组分之一，它可通过ASA-GSH-NADPH循环催化ASA氧化以清除H2O2等，对细胞起到保护作用。在胁迫条件下，活性氧数量增加、诱导酶活性增强，启动以上酶系统对积累的活性氧进行清除。本实验结果表明:在 Se胁迫条件下，添加低浓度(0.5 mmol·L-1)EDDS，彩叶草叶片的SOD、CAT和APX活性明显低于对照;添加1.0 mmol·L-1EDDS，3种酶活性均降至最低，分别比对照降低 32.5%、35.5%和 66.2%，而POD活性却急剧升高;但随着EDDS浓度的提高，POD活性不断降低，SOD、CAT和APX酶活性却明显升高。说明在Se胁迫条件下，低浓度的外源EDDS通过增强彩叶草的POD活性消除过量的H2O2自由基，减缓胁迫的毒害;但POD的防御能力有限，随外源EDDS浓度的提高，EDDS和Se共同作用使POD活性受到抑制，导致彩叶草POD活性下降，H2O2自由基消除过程受阻，在此条件下SOD、CAT和APX再次被启动，并对胁迫过程中积累的活性氧进行清除。

GSH是生物细胞中含量最丰富的非蛋白质硫醇化合物，在生物体内不同的胁迫响应途径中，细胞可利用GSH的亲核活性消除活性氧和重金属等对细胞的伤害［39］。本研究中，在Se胁迫条件下，外源EDDS浓度低于1.0 mmol·L-1，彩叶草叶片中的GSH含量显著高于对照，随着EDDS浓度的提高，叶片中GSH含量逐渐降低但仍高于对照。这可能是由于在低浓度EDDS条件下，一方面GSH通过提高保护酶活性清除活性氧;另一方面GSH可以螯合重金属，从而降低游离重金属离子的含量。GSH是金属螯合肽合成的重要前体，金属螯合肽的合成量增加，将解除重金属与酶蛋白的结合，提高酶活性，从而减轻细胞受到的毒害。GSH-Px也是生物体内广泛存在的一类重要的催化H2O2分解的酶，其活性可以作为衡量机体抗氧化系统改变的重要指标之一。本研究中，在Se胁迫条件下，添加不同浓度EDDS后彩叶草叶片中GSHPx活性的变化趋势与GSH含量相一致，虽然活性较低，但均显著高于对照。

由于EDDS对污染环境修复的效应受其浓度和溶液pH值、重金属元素种类、土壤基本性质以及植物种类等因子的影响，加之目前对其诱导机制尤其是从根部向茎叶的传输机制还缺乏深入研究，从而影响其广泛应用。因此，如何有效地将EDDS应用到实践中是未来污染环境修复的一个重要研究课题。

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