吸烟对氯吡格雷抗血小板活化作用的影响

徐 鹏 王宁夫 周 亮 叶显华 童国新 冷建杭

最近有研究报告，由于吸烟具有促进氯吡格雷向活性产物转化的作用，故吸烟可以使氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的作用增强，而且冠心病的预后也显著得到改善［1］。对这些研究结果的解释和一些专家的观点与以往吸烟有害的研究结论相矛盾，在学术界引起关注和争论。然而，吸烟作为心血管疾病的独立危险因子，其致病作用已得到明确证实，大量临床研究显示吸烟者患冠心病的危险是不吸烟者的1．5～4.0倍;吸烟者患心肌梗死的危险是不吸烟者的3倍左右。因此吸烟有益于增加氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的结论有待于进一步验证。本研究旨在验证吸烟是否在冠心病患者冠状动脉介入治疗(PCI)术后近期有增强氯吡格雷抗血小板活化作用。

对象与方法

1．入选标准:随机入选2009年2～10月在笔者医院诊断为不稳定心绞痛初次择期行冠脉造影的病人，符合冠脉介入治疗(PCI)术标准并成功地行介入治疗的病人分为吸烟组(22例)和非吸烟组(20例)。吸烟组的标准:吸烟1年以上并且近24h内吸烟，每日超过10支;非吸烟组的标准:既往无吸烟史和已经戒烟10年以上者。

2．排除标准:两组均排除急性心肌梗死、既往吸烟但已戒烟或虽然未戒烟而近24h内未吸烟者、氯吡格雷过敏、过去两个月内有献血史、出凝血功能障碍、胃肠道手术史(阑尾切除术除外)、肝肾疾病、病毒性肝炎携带者、甲状腺功能亢进或减退、肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、有其他动、静脉血栓疾病者及重度心力衰竭(NYHAⅣ级)。

3．服用药物:所有患者入院后即顿服拜阿司匹林300mg、氯吡格雷300mg，随后按拜阿司匹林100mg每天1次、氯吡格雷75mg每天1次服用，同时根据冠心病治疗原则服用他汀、硝酸酯等药物，有高血压、糖尿病者继续服用相关药物;冠脉造影后如需行PCI术者，术后继续服用氯吡格雷75mg每天1次、拜阿司匹林100mg每天1次。拜阿司匹林100毫克/片，产自德国拜耳公司，氯吡格雷75毫克/片，产自法国赛诺菲－安万特公司。

4．样本采集:所有患者入院后即采集外周静脉血3ml;PCI术后患者在术后24、72h早晨空腹再次采集外周静脉血3ml。将所采集的静脉血加入3．13%枸橼酸钠(CTAD)抗凝管。

5．活化血小板的测定:荧光抗体染色:采用三色荧光染色，于FALCON试验管中加入 PAC－1－FITC、CD62p－PE、CD61－PerCP抗体各20μl，各管分别加入混匀的全血5μl;在对照管中加入 PAC－1－FITC、IgG1－PE、CD61－per－cp各20μl及RGDS 10μl。室温下避光孵育20min，加入2～8℃1%多聚甲醛(PFA)，充分混匀，阴暗处放置，24h内上流式细胞仪分析检测。流式细胞仪(FCM):开机后以CaliBRITE3荧光微球和FACDComp自动软件检查仪器灵敏度，并自动设定实验的获取条件，包括光电倍增管(PMT)电压和荧光补偿等，然后以CellQuest软件用样本进一步优化实验获取条件，并检测各组样本管，获取10000个细胞，最后用 CellQuest软件分析CD61、CD62p阳性颗粒的百分率。所有试剂均由美国BD公司生产，固定液PFA由美国Sigma公司生产，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

6．统计学方法:数据统计及计算使用SPSS 16．0完成，各组数据以均数±标准差表示，基线数据比较采用卡方检验，各组实验数据间比较采用t检验，p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．基线情况:两组在年龄、高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管病及服用质子泵抑制剂(PPI)等方面的差距无明显统计学意义(表1)。

2．服用氯吡格雷前和PCI术后24、72h的CD61、CD62p改变:服用氯吡格雷前和PCI术后24、72h的CD61、CD62p的各组数据资料见表2。

3．服用氯吡格雷前和PCI术后24、72h的CD61、CD62p表达率、差值的比较见表3。数据显示，两组术后24、72h的CD61、CD62p阳性表达率与术前比较无显著改变;其中术后24h两组的CD61、CD62p表达较术前均有下降的趋势，但组间比较无明显统计学差异;吸烟组在术后72h的CD61、CD62p表达较术前仍有下降趋势，而非吸烟组已无下降表现，但是组间比较也无统计学差异。

讨 论

烟草烟雾中的一氧化氮、一氧化碳、氧自由基等物质损害血管内皮、增加血液黏稠度和血小板聚集、活化的能力、促进血栓形成，诱发或加剧心血管疾病，不论主动还是被动吸烟者，心血管疾病都明显增加。吸烟作为心血管疾病的独立危险因子，其致病作用已得到明确证实，但是近期对一些吸烟与血栓的临床试验结果的解释造成一些学术争论。CLARITY－TIMI 28试验的结果分析发现，氯吡格雷降低了冠脉造影前总体梗死相关的主要终点事件和病死率，但吸烟≥10支/天者获益要明显高于不吸烟者;同样，氯吡格雷在降低30天全因死亡、心肌梗死和急性血运重建方面，吸烟≥10支/天者也优于不吸烟者［1］。Jeong等［2］对138名急性心肌梗死并且进行支架置入的患者进行研究，发现每日抽烟≥10支的患者其5和20μmol/L ADP诱导下的血小板聚集率都明显低于非吸烟者(40．9% ± 16．1%vs 46．6% ± 11.7%，P=0.028，53．8% ± 16．6%vs 59．2% ± 12．2%，P=0.040)，在吸烟的健康志愿者和急性ST段抬高性心肌梗死患者身上发现氯吡格雷的抗血小板作用有增加的表现。

对此类研究结果如何解释是目前学术争论的焦点。一些作者认为吸烟促进了氯吡格雷向其活性成分的转化。氯吡格雷属第2代噻吩吡啶类药物，其原药无活性，体内经肝脏细胞色素P450转化的代谢物方具抗血小板聚集活性。Yousef等［3］观察了正常志愿者吸烟对氯吡格雷药代动力学的影响，发现相对非吸烟者，吸烟者的氯吡格雷(原形及无活性羧酸代谢产物)曲线下面积(AUC)下降30%，半衰期下降35%，而血浆峰值浓度和达峰值浓度的时间无差异。研究发现吸烟可以干扰 CYP亚型，诱导CYP1A2、CYP2C19等的表达，从而促进氯吡格雷向活性产物方向的代谢［4，5］。

事实上，吸烟是否增加氯吡格雷的抗血小板作用，学术界也有一定的争议，Cho等［6］的相关研究证实在急性心肌梗死患者中吸烟与血小板活性的降低没有相关性，而PCI术后吸烟≥10支/日的患者氯吡格雷也没有进一步降低血小板活性。

另一种观点认为吸烟本身有急性诱导血小板聚集的作用，氯吡格雷阻断血小板聚集作用的增强是一种对吸烟者造成凝血功能失调的的反应，在某种程度上也表明吸烟者与非吸烟者可能在血栓发生机制上有所不同，吸烟者更需要氯吡格雷治疗。Addad等［7］对稳定型冠心病患者的研究证实这一观点。Cucina等［8］研究证实烟草中的尼古丁可以增加血管内皮细胞和巨核细胞表面P2Y12受体的表达，虽然该实验没有直接有关于血小板的数据，因为血小板由成熟的巨核细胞脱落而来，故推测血小板分泌的ADP表面P2Y12受体表达也因吸烟而增加，从而使氯吡格雷的抗血小板作用增加。

本实验采用常用的血小板活化标志物CD61、CD62p作为观测血小板活化程度的指标。Cd61是血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)代表的CD抗原，与GPIIb构成GPⅡb/Ⅲa复合物，是血小板含量最多的糖蛋白，研究证实GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合是血小板聚集的最后通路［9］。CD62p是α颗粒膜表面的糖蛋白GMP－140代表的CD抗原，又称P－选择素，其在血小板质膜上的表达或其阳性血小板的百分率的增加被认为是活化血小板的特异性标志物［10］;CD62p的强表达在血小板活化后10min时出现，活化有赖于 GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合，因此CD62p是血小板活化的晚期标志物［11］。本试验数据显示PCI术前、术后两组间CD61、CD62P的表达没有明显差异，术后24h的CD61、CD62P的表达较术前有所下降(CD61:－1．16% ±19．06%vs －0．98% ±22．19%，P=0．36;CD62p:－ 1．93% ± 10．80%vs－2．07% ±15．49%，P=0．96)，可以认为与氯吡格雷的抗血小板作用有关;术后72h吸烟组的CD61、CD62P的表达较术前仍略有下降，非吸烟组则不再降低(CD61:－2．19% ±21.72%vs 5．27% ±26.58%，P=0．46;CD62p:－6．13% ±18.74%vs 0．12% ±12.78%，P=0．25)，两组间比较没有统计学意义。即本实验的结果显示吸烟未能增强冠心病患者PCI术后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用。

本实验未能进一步验证CLARITY－TIMI 28等试验的结论，可能的原因有:①吸烟增强氯吡格雷抗血小板作用，同时也增加了血小板活化能力，两者的作用有所抵消;②CLARITY－TIMI 28等试验中未进一步明确入院及随访过程中的戒烟情况，不良终点事件的减少还可能与戒烟本身有关，因为终点事件的减少与吸烟的数量明显相关;③上文中提到的一些氯吡格雷相关的试验是在健康志愿者或者体外完成的，且氯吡格雷存在较大的个体差异性，吸烟对氯吡格雷抗血小板作用的影响究竟如何，目前尚缺乏大规模临床证据。

因为目前关于吸烟对氯吡格雷抗血小板作用方面的实验不多，而且相关试验中以CD61、CD62p等标志物来测定血小板作用的报道较少。由于受样本偏少、患者合并高血压等疾病的影响及入院后短期减少或停止吸烟等因素的影响，本研究结果有一定的局限性。因此，吸烟是否可以增加氯吡格雷的抗血小板作用，还需大样本的临床观察以进一步明确。

本实验表明吸烟的冠心病患者未发现PCI术后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用增强，因此本实验未能验证吸烟能增加冠心病患者PCI术后近期氯吡格雷的抗血小板活化作用这一结论。关于吸烟者PCI术后服用氯吡格雷是否有额外临床获益的问题，本文未做探讨，还需大样本的临床观察以进一步澄清。

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