德国苹果病毒病分子检测与防控技术考察报告

李元军 周先学 赵玲玲 苏佳明 唐美玲

山东省烟台市农业科学研究院·265500

为执行国家外国专家局出国培训项目CG2011370012“苹果病毒病的分子检测与防控利用”，由山东省烟台市农业科学研究院5名科技人员组成的培训团于 2011年8月20日至9月9日赴德国栽培作物联邦研究中心(JKI）果树及葡萄栽培植物保护研究所进行了为期21 d的技术培训，期间考察了解了德国关于苹果病毒病、苹果植原体病害的研究新进展，学习了苹果茎痘病毒、苹果花叶病毒和苹果褪绿叶斑病毒的分子检测技术，特别是带病毒样品处理、RNA提取、反转录PCR及凝胶成像等关键检测技术与方法；还参观了该所的果树病毒纯种保存圃与温室，实地学习、观察了多种苹果病毒病在苹果树上的表现症状以及病毒传播途径。另外，还与研究所的果树昆虫学、植原体学、真菌学和细菌学等方面专家以及部分地区生产部门的技术人员进行了座谈，初步了解与学习了德国苹果病毒病的检测与防控技术，以及果树生产与科研现状，现将有关情况总结汇报如下。

1 研究所概况

JKI，位于德国海德堡市道森汉姆镇。其主要任务是开展农作物植物保护、产品评估、果树与葡萄的病虫害和有害生物传播途径、植物保护防控技术措施、抗病性优良新品种选育等方面的研究以及果树病虫害的预测预报与预警机制的建立。

该所共有9个研究室，主要从事果树细菌学、真菌学、植原体、病毒等果树植物保护及葡萄栽培研究。其中果树植物保护研究方面有6个研究室，分别是果树细菌学与火疫病研究室、化学生态学与植物病理学研究室、果树昆虫学研究室、果树真菌学研究室、果树植原体研究室、果树病毒与类病毒研究室；葡萄栽培研究方面有3个研究室，分别是葡萄真菌研究室、葡萄流行病载体研究室、葡萄昆虫研究室；以及1个国际学员培训中心（大学联合）和2个试验农场。现有主要课题项目负责人14位。近10年来，先后承担欧盟、联邦政府和地方项目55项。在《病虫害科学》《细菌学》《化学生态学》《作物学报》《植物病理学》《园艺学文摘》等国际知名刊物发表论文260余篇。

JKI是联邦政府在奎德林堡建立的一个国家级权威的独立研究机构。JKI目前拥有1200名科研人员，其中包括300名科学家，在柏林 (Berlin and kleinmachnow)、 奎德林堡（Quedlinburg）、不伦瑞克(Braunschweig)和道森海姆(Dossenheim)等地共有15个研究所，以及信息中心、图书馆等机构。JKI致力于研究植物遗传、作物栽培、植物营养、土壤科学、植物保护和植物检疫等栽培植物生物学的广泛领域，这使得JKI在作物种植产业中起到了至关重要的作用。

果树及葡萄栽培植物保护研究所隶属于

2 苹果病毒病和植原体病害研究

2.1 病毒病研究 早在19世纪50年代，德国已开始进行对苹果病毒种类的调查鉴定工作。到目前为止，德国已报道的苹果病毒及其类似病原物有30多种。主要包括苹果花叶病毒(APMV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV)。关于苹果病毒病的检测，由于指示植物法所需检测时间长，而酶联免疫法存在假阳性率高等缺点，目前德国主要应用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术。该方法敏感性和特异性都大大增强，并且很适合大量样品的快速检测。此外他们还发展了多重RT-PCR，实现了在一个反应体系中不但可以对一种类病毒核酸进行扩增，而且可以同时对多种类病毒核酸片段进行扩增，此法在检测果树病毒复合侵染时很有效，且省时省力。利用RT-PCR方法检测和鉴定果树病毒，最重要的一个步骤是RNA的提取。关于植物总RNA的提取，最常用的方法是CTAB法和二氧化硅吸附法。目前在德国最常用的方法是二氧化硅吸附法，与CTAB法相比，该方法操作简单，RNA稳定性好，常温操作，不需对提取药剂进行特殊处理。所需时间短，1 h即可完成整个提取过程。提取完成后，利用RT-PCR技术鉴定病毒的种类，必要时进行序列测定。对于获得的新的果树病毒他们一般接种到指示植物进行生物学鉴定，以确定该病毒在果树上的表现症状，用于该病毒的田间诊断。所谓指示植物，是指对某种或几种病毒及类似病原物或株系具有敏感反应并表现明显症状的植物。由于所有果树病毒都可通过嫁接传染,所以可以通过嫁接，使病毒从待检植物传到指示植物。在德国生产上常用的指示植物有：弗吉尼亚小苹果(Virginia Crab)、司派227 (Spv227)、光辉 (Radiant)和苏俄苹果(R12740～7A)。其中，弗吉尼亚小苹果可检测茎痘病毒和茎沟病毒；司派227和光辉可检测茎痘病毒；苏俄苹果可检测褪绿叶斑病毒。指示植物鉴定法可在大田或温室进行，也可采用试管嫁接方法在超净工作台上进行。关于苹果病毒病的接种方法，德国研究学者主要应用摩擦接种和农杆菌侵染接种两种方法。所谓摩擦接种果树病毒，是将果树病毒的提取液滴于健康植物的表面，利用摩擦方法造成的伤口以接种果树病毒的方法。该方法操作简单，转染成功率一般在75%左右，其缺点是需要对大量的转染植株进行鉴定。另一种接种果树病毒的方法是农杆菌侵染接种法，该方法的操作步骤是首先利用RT-PCR技术克隆病毒的全长，构建该病毒的表达载体，最后利用农杆菌侵染的方法将病毒转化进受体植物。该方法的操作过程比较复杂，但是对于新发现的一些果树病毒，主要利用该方法进行接种鉴定。关于苹果病毒病的保存，德国主要将带有果树病毒的材料应用嫁接保存。

2.2 植原体病害研究 果树植原体病害是一种非常重要的细菌病害，果树得病后能引起黄化、丛枝，发病严重的能引起果树的死亡。该病由昆虫进行传播。由于目前世界上关于该病的代谢途径和病原菌与寄主植物的互作研究甚少，因此JKI关于该病的研究主要集中在对该病的检测、诊断、新病原菌发掘、寄主植物与病原菌的互作研究等方面。目前，德国对该病的防治方法研究主要集中在抗病新砧木的培育上，他们对抗病砧木的选育目标是选育出抗病性强、矮化的新型砧木。目前该所已选育出30多个抗病性强砧木，其中有2个砧木已经在意大利等国家进行区域性试验。

3 苹果病毒脱毒技术研究

因为苹果病毒是通过嫁接传染，一旦传染上病毒，无有效药剂防治。所以德国果树病毒病的防治，主要通过栽培无病毒和抗病毒或耐病毒的品种。而采用无病毒苗木，是防治苹果病毒病的最有效也是最根本的途径。目前德国主要采用热处理结合茎尖培养的方法获得无病毒材料。其具体做法是：首先将植株在27～35℃预处理 1周，以增加其存活力，然后将苹果苗置于34～36℃环境中生长3～4周，去除苹果病毒。热处理结束后，剥取1 mm左右的茎尖进行培养，然后通过检测获得无病毒的果树材料。由于热处理可脱除褪绿叶斑病毒、茎痘病毒，而茎尖培养易脱除茎沟病毒。所以将热处理和茎尖培养相结合，可以使两种方法互补，提高脱毒率，而且省去了热处理后嫩梢嫁接环节，茎尖大小可切到1 mm，易分化出苗，可减少变异后代的发生率。该方法的脱毒率可达50%～83.3%。热处理的材料一般分盆栽苗与组培苗两种，热处理方式可分为恒温与昼夜高低变温两种。为了避免对植株的伤害，组培苗脱毒可用昼夜高低变温方式。目前，该方法是德国研究人员普遍应用的脱毒技术。

此外，德国研究人员还利用在果园中选择健壮、丰产的植株及新育成的品种（品系）进行病毒鉴定，确认无病毒后，培育成母本树，以及直接从国外引进无病毒品种接穗，培育成母本树；以及采用病毒抑制剂结合茎尖培养等方法获得无病毒植株。目前，德国已经获得了225个脱毒的果树品种或品系。实现了对所有推广果树品种的脱毒处理，生产上实现了无毒化栽培。

4 德国病虫害防控技术研究

德国生物防控中心于1970年组建，隶属于德国作物研究中心（JKI）。目前该中心拥有职工55人，其中15个科学家，8个博士生，40个试验工人。其主要以虫害研究为主，注重生物防控技术和产品的研发。主要应用的生物防控手段包括以真菌、细菌、病毒、杀虫灯、天敌等抑制果树病虫害的发展。近来，该中心研制了一种昆虫病毒制剂，在谢花后喷洒可有效防治苹小食心虫，在德国已推广200多hm2。他们还利用植物提取物防治果树的真菌病害，他们在甘蔗中提取了一种多酚类活性物质，该物质不仅能杀死病菌芽孢，还能诱导目标植物产生抗性物质，对防治果树一些真菌病害非常有效，目前正在进行大田试验。

5 赴德国学习考察的感想与建议

5.1 针对烟台市果树病毒病的发生现状，长期不断地开展果树病毒研究工作 病 毒 病是危害果树的最重要的病害之一，果树病毒病一旦发生，将给果树生产带来巨大的经济损失。目前世界上对果树病毒病没有有效的防治方法。栽植无毒苗木是防治果树病毒病的唯一途径。德国政府对果树病毒病十分重视，德国的果树生产已经于上世纪90年代全部实现无毒化栽培。而我国果树无毒化苗木计划始于20世纪90年代，经过十几年的发展，目前栽植无毒苗木的果园仅在3%左右。据调查，烟台市苹果园的果树病毒病的带毒率已高达60%以上，病毒病给我市带来的经济损失是巨大的。上世纪90年代中期，我市科研单位开始开展苹果病毒病的研究，由于种种原因，进展一直非常缓慢。直到最近几年，才又重新开始苹果病毒病研究和脱毒工作。而且我们现在开始的研究工作仅限于果树品种的脱毒和检测等基础性工作，而德国的果树病毒研究重点已经转入病毒的致病机理、病毒与寄主植物的互作等研究领域，我国的果树病毒研究工作与德国相比还存在很大的差距。因此，对果树病毒病的研究，应长期不间断的持续开展。

5.2 进一步加强果树病毒病研究的国际间科技合作 目前，果树病毒病的研究是一项全球化共同研究的课题。我国的果树病毒病研究与西方发达国家相比，还存在较大差距。我们应该按照“请进来与走出去”相结合的思路，开展果树病毒病基础研究、无病毒果树新品种的引进、病毒病的防控等果树病毒病相关研究的国际间科技合作。同时，利用国外先进的果树病毒病研究的最新成果，解决我国果园的病毒病问题。

此外，培训团从德国引进了部分性状优良的苹果、梨、葡萄等优良品种和砧木资源，丰富了我国的果树种质资源。通过学习，对德国果树病毒病的研究现状、最新的研究手段和方法、果树育种和生产科研现状，有了较为细致的了解。与德国作物研究中心植物保护和葡萄栽培研究所建立了良好的友好合作关系，拓宽了科研合作的范围，而且双方共同申报了中德政府间科技合作项目，为今后互派人员进行果树交流合作，加强国际间的合作与交流奠定了基础。这些国际合作和交流将极大地提升我国特别是烟台地区病毒病科研水平。