氮和铁对小球藻和微拟球藻油脂积累的影响

王 辉，陈来喜，肖爱凤，李洪武

（海南大学 海洋学院，海南 海口 570228）

氮和铁对小球藻和微拟球藻油脂积累的影响

王 辉，陈来喜，肖爱凤，李洪武*

（海南大学 海洋学院，海南 海口 570228）

以在海南分离的藻株小球藻HNC1（Chlorella sp.HNC1）和微拟球藻HNN1（Nannochloropsis sp.HNN1）为材料，研究N和Fe3+对细胞油脂积累的影响.结果表明：N缺乏条件促进了小球藻和微拟球藻细胞的油脂积累，但对生长有抑制作用.与对照相比，培养基中Fe3+的缺乏抑制了小球藻的生长和油脂的积累；Fe3+缺乏对微拟球藻的油脂积累有抑制作用；但对其生长无明显影响.富Fe3+处理对小球藻的油脂积累具有刺激作用，但对微拟球藻无显著影响；富Fe3+和正常铁条件下小球藻和微拟球藻的生长无显著差异.

旅小球藻；微拟球藻；油脂积累；生长状态；铁；氮

由于化石能源的日趋减少以及大量地使用化石能源造成的环境污染的不断加剧，以动植物为原料的生物柴油的开发和应用再次受到广泛关注.在各种可再生能源的资源中，微藻具有生长速度快、生物质产量高和含油量高等特点.全球石油俱乐部（Global Petroleum Club）的统计数据表明，微藻油脂的单位年产量是油棕的15倍，大豆的75倍，油菜籽的200倍[2].其次是微藻，尤其是海水种的，培养不与农业争耕地和淡水、不影响食物安全保障和破坏生境等多方面优势而引人瞩目,微藻生物柴油成为目前人们关注的热点话题之一[1-3].

许多研究结果表明大部分藻类在营养胁迫的条件下能积累更高含量的油脂，但营养缺乏又会降低藻体的生长速度，因此在实际生产中要使油脂产量最高以致是成本达到较低水平，就必须在微藻总生物量和细胞油脂含量间寻求平衡.微藻油脂的含量随微藻种类的不同而差异悬殊.影响微藻油脂积累的因素有很多，研究结果表明：缺氮处理可以提高微藻细胞的油脂含量，某些单细胞微藻可大量积累油脂，含油量甚至可高达60%[4-5]，同时有研究发现，培养液中高浓度的FeCl3对海水小球藻（Chlorel⁃la vulgaris）的油脂积累有明显的促进作用，可使其质量分数高达干质量的56.6%[6]，因此作者以从海口近海海域中分离获得的两珠绿藻——小球藻（Chlorellasp.）HNC1和微拟球藻（Nannochloropsissp.）HNN1为研究对象，研究了缺N、缺铁、富铁三种特殊处理对其细胞生长状态和油脂积累的影响.

1 材料与方法

1.1 藻种与培养

野外水样采自海口周边海域，对水样中的微藻进行分离、纯化.藻种筛选及培养在恒温震荡培养箱中（转速130 rpm/min），用不加Si的F/2培养基[7]（记为f/2-Si），培养温度约为26±2℃，光照强度约8000～10000 Lx，光暗比为14h∶10h.

1.2 分析方法

1.2.1 生长测定

用可见分光光度计（722型）测定藻液在500 nm处的吸光值，根据公式y=2×107x计算细胞数[8].1.2.2总脂含量测定

油脂积累的测定，脂质与尼罗红荧光染色溶液结合能发出荧光检测信号，脂质的量与荧光强度成正比可以快速、可靠地测定活体细胞内脂质的量.研究结果表明，经尼罗红染色后的小球藻在480 nm光激发下，位于580 nm的荧光峰的强度与称质量法测定的总脂含量呈线性正相关[6-11].因此，本实验采用同样荧光分光光度法直接测定细胞的中性脂含量.具体方法为：2 mL藻液加0.01 mL的尼罗红染料（质量浓度为0.1 g/L丙酮）染色5 min，然后用荧光分光光度计（MC960），用480 nm光激发，测定荧光发射光谱，以波长为580 nm的荧光强度减去藻细胞和尼罗红在该波长处的荧光值，所得相对荧光强度与细胞中总脂含量呈线性关系.

1.2.3 统计分析

对3次平行试验结果，用DPS数据数理系统进行统计分析[12].

2 结果与分析

2.1 氮对小球藻、微拟球藻生长的影响

试验采用可见分光光度计观测小球藻和微拟球藻的生长，用公式y=2×107x[8]R2=0.993p＜0.05，可以将紫外吸光值（OD500）转换成细胞数目，x为OD500值，y为1 mL藻液的细胞数目，经转换得出微藻的生长状况见图1.

由图1可知，缺氮培养液和正常培养液中的小球藻生长差异显著，在培养到第7d后，正常氮培养的小球藻达到了指数生长期，而缺氮培养的处于生长的延缓期.在培养的前3d，缺氮培养的和正常氮培养的微拟球藻的生长差异不显著.在培养的第7d后，正常氮培养条件下的微拟球藻显著高于缺氮处理的（P＜0.05）.

图1 氮对小球藻和微拟球藻生长的影响Fig.1 The impact of N on the growth of Chlorella and micro-alga

2.2 铁对小球藻、微拟球藻生长的影响

由图2显示小球藻富铁处理和正常铁处理的生长显著（P＜0.05）好于缺铁处理的小球藻，富铁处理的小球藻在培养的第17d把铁浓度增加到正常培养基的2倍，也就是10 mg/L.在第19d把铁浓度增加到2.25倍，也就是12.25 mg/L，结果与正常铁比较没有明显差异，但都显著高于缺铁处理的.微拟球藻在生长初期缺铁处理生长优于其他处理，但在后期不同铁浓度下生长情况无显著差异，虽然在第17d时也把富铁处理的铁浓度增加到正常铁浓度的2倍，也没有产生显著的影响.

图2 铁对小球藻和微拟球藻生长的影响Fig.2 The impact of Fe on the growth of Chlorella and micro-alga

2.3 氮对小球藻和微拟球藻油脂积累的影响

试验通过将处于指数生长后期的小球藻经4000 g离心5 min后，细胞重悬于缺氮的f/2-Si培养液中培养，用分光光度法测定生长和油脂积累的动态过程，经尼罗红染色的小球藻，用480 nm光激发时的荧光发射图谱图3所示：在培养的前3天，两种培养液中的小球藻培养的油脂积累差异不显著，第3天后，缺氮培养液和正常氮培养液的小球藻油脂积累差异极显著.并且缺氮培养液中的小球藻在第7d出现最高的油脂积累.结果显示，缺氮培养基对小球藻的油脂积累有显著影响.

图3 氮对小球藻和微拟球藻油脂积累的影响Fig.3 The impact of N on the lipid accumulation of Chlorella and micro-alga

与小球藻同步进行试验的微拟球藻，其生长和油脂积累的动态过程，其结果与小球藻一样，同样得出缺氮对微拟球藻的油脂积累有显著影响.经尼罗红染色后的微拟球藻液的荧光图谱见图3，微拟球藻培养自第2d起，正常氮培养下和缺氮培养下的藻细胞油脂积累差异越显著，到第7d缺氮培养液的微拟球藻出现最高油脂积累峰值，由此可知，缺氮培养同样能够促进微拟球藻油脂的积累.

2.4 铁对小球藻、微拟球藻油脂积累的影响

经尼罗红染色的小球藻和微拟球藻，荧光发射光谱见图4.小球藻在富铁和正常铁情况下，脂类积累呈上升趋势，富铁情况下小球藻的脂积累出现两次高峰，并且富铁情况下首先出现脂质积累.而在缺铁情况下没有出现脂积累峰.

如图5所示，微拟球藻在富铁和正常铁情况下也出现脂积累积累情况，富铁情况下积累高峰稍大于正常铁情况.在缺铁情况下则没有出现脂积累.

图4 铁对小球藻油脂积累的影响Fig.4 The impact of Fe on the lipid accumulation of Chlorella

图5 铁对微拟球藻油脂积累的影响Fig.5 The impact of Fe on the lipid accumulation of micro-alga

3 讨论

试验结果表明氮元素是限制小球藻和微拟球藻生长的因子，但当藻类受到氮胁迫时，微拟球藻和小球藻仍能继续生长，是由于光合作用并未中断，碳元素的同化作用仍继续进行，导致脂肪酸合成模式的改变，转而合成中性的甘油三酯，并以油滴的形式贮藏在细胞质中.脂肪酸的合成与乙酰辅酶A羧化酶的酶活及酶量有关，微拟球藻和小球藻在缺氮的培养条件下油脂“急速”积累，是氮源的缺乏诱导了微拟球藻和小球藻细胞中乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的活性或其细胞油脂合成时使乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）达到限速时所需的酶量.是氮源改变了酶的功能，从而使用于生长的一部分营养转化成为油脂积累的转变，而且它的高含油量于高生长速率是呈逆相关的[13-15].

Fe3+是藻细胞内叶绿素的重要组成部分，可以促进叶绿素合成过程的酶活性，是藻类细胞内某些辅酶和氧化还原载体的组成部分.研究表明，在高浓Fe3+条件下培养Chlorella vulgaris，改变了藻株的代谢途径，使油脂出现两次积累高峰，含油量提高了7倍，达细胞干重的56.6%，并且高Fe3+浓度对藻株生长影响不大[2].在小球藻中观察到的这种油脂大量积累现象，可能是由于已糖库的代谢途径由合成淀粉为主转变为合成油脂，分叉点在于磷酸已糖的调用方向[16].本实验结果表明，不同铁浓度的培养基对两种单细胞绿藻的生长和油脂积累均有影响，但是富铁后期对小球藻和微拟球藻油脂积累影响并不显著，对这两株藻种富铁处理后期已糖库的代谢途径中磷酸已糖的调用方向是需要进一步的研究的关键问题.

研究结果表明在本实验中提取的小球藻和微拟球藻在缺氮和不同铁浓度的培养基中油脂积累均有一定的影响.以期筛选出适于作为生物柴油原料的藻种，为生物质能源藻种的筛选提供了基础，使微藻成为生物柴油的原料更具有研究前景的趋势.

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Effect of N and Fe on the cell lipid accumulation of Chlorella and Nannochloropsis

WANG Hui，CHEN Laixi，XIAO Aifeng，LI Hongwu＊
（College of Ocean，Hainan University，Haikou570228，China）

Taking the algae Chlorella HNC1（Chlorella sp.HNC1）and micro-algae HNN1（Nannochloropsis sp.HNN1）separated in Hainan as the research material,the effect of N and Fe3+on the cell lipid accumulation was stu⁃diced.The results show that:Lack of N can promote the cell lipid accumulation of the chlorella and micro-algae,but the growth was inhibited.Compared with the control,lack of Fe3+in the medium inhibited the growth of Chlorella and oil ac⁃cumulation;lack of Fe3+inhibited the lipid accumulation of micro-algae,but had no effect on their growth,Rich Fe3+can stimulate the lipid accumulation of chlorella,oil,but has no effect on the micro-algae;There was no significant differ⁃ence for chlorella and micro algae in the condition of rich or mormal Fe3+.

chlorella sp.；Nannochloropsis sp.；Oil accumulation；growth condition；Fe；N

Q 331

A

1674-4942（2012）01-0086-04

2011-12-10

国家自然科学基金（40966002）；海南大学2009科研项目（hd09xm56）；海南省自然科学基金（409001）；海南大学211工程创新人才项目计划资助

*通讯作者

黄 澜