Jade－1及β－catenin在肾癌组织中的表达及临床意义

练 鑫 翁志梁 吴秀玲 陈盛烨 王思齐 李澄棣

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常见的肾实质恶性肿瘤，晚期治疗缺乏有效手段。Jade－1是一种抗增殖和促凋亡蛋白，广泛存在肾细胞中的一种泛素连接酶，通过泛素化作用降解蛋白，调节蛋白质的功能［1～3］。Jade－1在肾细胞癌的发展过程中是一个抑制因素，目前国内对其研究未见报道。Wnt信号通路在细胞的分化、增殖和凋亡等生理过程及细胞癌变、肿瘤侵袭等病理过程中发挥重要调控作用。β－catenin参与多种致癌信号，在多种人类肿瘤中过表达，是Wnt通路的关键信号蛋白［4］。Jade－1介导的Wnt/β－catenin信号通路异常激活是近年提出的一种新的调节机制［5，6］。鉴于此，本研究采用免疫组化和荧光定量RT－PCR检测Jade－1与β－catenin在肾癌组织中的表达情况，分析两者与临床病理特征关系，并分析它们表达的相关性，初步探讨Jade－1在肾癌发生发展过程中的作用，为阐明肾癌发生的机制和寻找治疗肾癌的方法提供有效依据。

材料与方法

1．标本:温州医学院附属第一医院2009～2011年间60例肾癌组织，其中肾透明细胞癌48例，乳头状细胞癌7例，嫌色细胞癌5例。男性38例，女性22例，患者年龄28～88岁之间，中位年龄56．0岁。按Fuhrman标准进行肿瘤分级，Ⅰ级31例(51.7%)，Ⅱ级 19例(31.7%)，Ⅲ ～Ⅳ级 10例(16.6%)。另收集同期经病理证实的11例远离肿瘤的正常肾脏组织标本作为对照。

2．主 要 试 剂:多克 隆 抗 体 Jade－1(sigma，Cat:HPA020016，工作浓度 1∶75)，β － catenin 抗体(BOISS，cat:bs－1165R，工作浓度1∶300);免疫组化和DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。Trizol(Invitrogen公司)，RevertAIDTM First Strand CDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)，SYBR(R)GREEN PCR Master Mix(美国ABI公司)。

3．免疫组化检测:采用Envision免疫组化二步法，Image－Pro Plus 6．0软件选取并分析阳性区域，计算积分光密度值(MD)来反映阳性蛋白的强度或浓度。

4．结果判定:Jade－1:(1)400倍视野的5个区域算染色阳性细胞百分率:≤5%计0分，6% ～25%1分，26% ～50%2分，50% ～75%3分，＞75%4分;(2)染色强度:基本不着色计0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。每张切片的染色细胞百分率得分和染色程度相加:≤3分为阴性(－)，4～5分为弱阳性(+)，6～7分为阳性(++)。阴性和弱阳性为阴性;β－catenin:以细胞质阳性细胞＜10%为胞质表达阴性，10% ～75%作为胞质表达弱阳性(+)，≥75%为胞质表达强阳性(++)。

5．荧光定量RT－PCR:(1)引物设计与合成:Primer Express 5．0设计引物，上海基康生物工程有限公司合成(表1)。(2)提取RNA及反转录反应:总RNA的提取及cDNA的制备根据Trizol RNA提取试剂盒说明书操作。(3)荧光定量PCR反应:提取组织总RNA经分光光度仪，选择OD值在1．8～2.0之间的RNA产物进行cDNA反转录。条件优化为反应体系 20μL:SYBR(R)GREEN PCR Master Mix 10μl，上下游引物各 0．5μl，引物终浓度为 200nM，cDNA 模板 1μl，双蒸水补足至20μl。反应条件:50℃ 2 min UNG酶作用消除前次反应产物的污染，95℃ 预变性 5min，95℃ 变性 15s，60℃ 复性延伸1min，40个循环。所有样本3次重复测定，每次实验包含阴性对照，GAPDH内参标准化。对 Jade－1、β－catenin、GAPDH基因扩增产物进行熔解曲线分析得到单一熔解峰，扩增效率检测接近100%。

表1 RT－PCR扩增的mRNA及内参的引物序列

结 果

1．免疫组化结果。(1)Jade－1和β－catenin蛋白的表达:Jade－1正常肾组织中为胞质高表达;在肾癌中低表达甚至缺失(图1)。β－catenin正常肾小管上皮胞质低表达或不表达;在肾癌中胞质高表达或蓄积(图2)。Jade－1阳性表达率为35．0%(21/60)显著低于正常肾组织100．0%(11/11)(χ2=15.864，P=0．000);β －catenin阳性表达率为 86．7%(52/60)，显著高于正常肾组织 27．3%(3/11)(χ2=21.089，P=0．000)。在其中48例透明细胞癌中，Jade－1阳性表达率为25．0%(12/48)显著低于正常肾组织100．0%(11/11)(χ2=21．163，P=0.000)，β － catenin阳性表达率91．7%(44/48)显著高于正常肾组织27．3%(3/11)(χ2=22．903，P=0.000)。进一步 Image－Pro Plus 6．0软件对所有采集图片行光密度分析，每例样本的测量结果是该样本全部图片的累计视野测量参数值(平均光密度=IOD SUM/area)的均数反映阳性蛋白的强度或浓度(图3)。(2)与临床病理学指标的关系:Jade－1表达与肿瘤大小、Fuhrman分级和临床分期密切相关(p＜0.05)，而与年龄、性别和淋巴结转移无明显相关(P＞0．05);β－catenin与Fuhrman分级和临床分期密切相关(p＜0．05)，而与年龄、性别、肿瘤大小和淋巴结转移无明显相关(P＞0.05)(表2)。(3)肾癌中Jade－1和β －catenin的相关性:经Image－Pro Plus 6．0软件光密度分析测量标本全部图片的平均光密度的均数所测结果绘制成散点图，发现Jade－1和β－catenin的表达伴随线性变化趋势，相关分析 r= －0．695，P ＜0．01(图4)。

表2 Jade－1和β－catenin在肾癌中的表达与临床病理学指标的关系

图4 肾透明细胞癌组织中Jade－1和β－catenin平均光密度相关性散点图

2．荧光定量RT－PCR结果:(1)Jade－1和βcatenin的mRNA的表达:采用2－△△CT方法分析。由表3所见，肾癌组的Jade－1表达水平下降，为正常组的0．202倍(p＜0．05)，两组间 β －catenin表达无显著性差异(P＞0．05)。总体而言，在肾癌中，Jade－1表达相对于正常组呈下调趋势，而β－catenin在肾癌表达无显著性差异(图5)。

表3 Jade－1和β－catenin在透明细胞癌和肾正常组织中的表达差异

图5 肾癌中，Jade－1表达相对于正常组织呈下调趋势，而两组间β－catenin表达无明显差异

讨 论

研究发现，Jade－1是肾细胞癌的一个候选抑癌基因［1］。目前对它的研究集中在肾癌细胞生长增殖调控等方面，研究结果提示［3］，Jade－1是一种通过与 VHL(Von Hippel－ Lindau)蛋白［7］相互作用而稳定富集于肾脏易降解的转录因子。VHL是一种在肾透明细胞癌的发生发展中通过VHL－HIF依赖途径起重要作用的抑癌基因。但非依赖途径的研究还不够系统全面［7］。Jade－1能抑制裸鼠中肾癌细胞生长和肿瘤形成。最近，Chitalia等［3］提出在肾细胞癌中VHL的缺失可以通过降解β－catenin导致肿瘤形成，是Wnt经典通路β－catenin的抑制剂和PVHL的重要调节者。Jade－1与bTrCP并联是β－catenin的E3泛素连接酶。据此推测Jade－1是E3连接酶的单一配体(而不是bTrCP)。pVHL依赖Jade－1下调β－catenin从而抑制Wnt通路，这一观点支持Jade－1和Wnt通路在肾癌发生过程中所起的作用。Jade－1因为pVHL而抑制Wnt信号代表了一种新的肿瘤抑制途径。据此把肾特异性pVHL肿瘤抑制通路和Wnt通路联系起来成为一种新的肿瘤发生通路。

Jade－1通过泛素化β－catenin及利用pVHL调节抑制来限制Wnt通路。据此，我们推测Jade－1和β－catenin可能成为肾细胞癌药物治疗的新靶点。国内对Jade－1的研究尚未报道，国外在实体肿瘤中的表达及作用研究也未见报道。

Jade－1在RCC胞质中表达缺失。Jade－1是一种抗增殖和促凋亡蛋白［3］。本研究显示，在肾癌中Jade－1表达阳性的比例显著低于正常肾组织(35%，p＜0．001)，提示Jade－1在 RCCC中表达降低。平均光密度结果显示肾癌组织Jade－1蛋白的MD值与正常组织比较显著降低(p＜0．05)。单因素分析的结果显示，Fuhrman分级高是Jade－1低表达的相关因素(OR=4．000，95%CI:1．081 ～ 14．805，P=0.032)。这可能与Jade－1通过泛素化β－catenin和利用p VHL调节Wnt通路的抑制来限制Wnt通路有关。Jade－1的表达还与肿瘤大小、Fuhrman分级和临床分期密切相关(p＜0．05)。

β－catenin在RCC胞质中积聚。β－catenin是促增殖和抗凋亡的一种致癌蛋白，其功能是一种连接蛋白，正常情况定位于胞膜内侧，信号蛋白作用在正常组织中被抑制［3］。然而在RCC细胞中β－catenin的胞质积聚现象十分常见，多项研究表明RCC细胞胞质中β－catenin蛋白的水平升高，上下游多种目标基因被激活［8，9］。本文 48 例 RCC 细胞中，44 例(91.7%)胞质β－catenin阳性表达，22例(50%)强阳性，与文献报道相仿。光密度结果肾癌组织βcatenin蛋白的MD值与正常组织比较显著升高(p＜0．05)。荧光定量RT－PCR结果显示肾癌和正常两组间β－catenin表达却无明显差异。目前对βcatenin在胞质中积聚的解释有多种。臧桐等［9］检测RCC细胞和正常肾组织中β－catenin的mRNA水平两者无明显差异，提出β－catenin的转录后调节异常为其胞质积聚的主要原因;β－catenin的磷酸化降解过程中有VHL蛋白参与，而在RCC细胞中VHL蛋白的表达却存在缺陷，提示β－catenin的胞质积聚可能与降解障碍有关［10，11］。Vipul等认为 β －catenin与Jade－1结合泛素化作用而被降解，从而抑制Wnt/β－catenin致癌信号通路。我们推测，VHL表达缺失引起Jade－1蛋白水平下调导致β－catenin的表达上调，蛋白异常蓄积，激活 Wnt/β－catenin致癌信号通路从而参与肾癌的发生发展。

RCC中Jade－1与β－catenin表达负相关。Jade－1是一种抗增殖和促凋亡蛋白，β－catenin则是促增殖和抗凋亡的致癌蛋白。Jade－1是Wnt通路βcatenin的抑制剂及PVHL的重要调节者。Jade－1通过泛素化β－catenin及利用pVHL调节抑制来限制Wnt通路。单和多因素分析结果均提示Jade－1与β－catenin的胞质表达呈负相关，Jade－1可能是Wnt/β－catenin信号通路的组成部分。在RCCC中，表达降低的Jade－1可能还与β－catenin及其下游激活的目标基因一起共同参与肿瘤的发生发展。

本研究结果表明Jade－1、β－catenin表达与肾癌组织的病理分级及临床分期密切相关。Jade－1通过泛素化β－catenin和利用pVHL调节Wnt通路的抑制来限制Wnt通路，其机制可能成为肾细胞癌药物治疗的新靶点。

1 Zhou MI，Foy RL，Chitalia VC，et al．Jade －1，a candidate renal tumor suppressor that promotes apoptosis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(31):11035 －11040

2 Ciechanover A．泛素介导的蛋白质降解系统——从基础研究到临床应用［J］．生命科学，2010，(3):212－215

3 Chitalia VC，Foy RL，Bachschmid MM，et al．Jade－1 inhibits Wnt signalling by ubiquitylatingβ－catenin and mediates Wnt pathway inhibition by pVHL［J］．Nat Cell Biol，2008，10(10):1208 －1216

4 Kikuchi A，Kishida S，Yamamoto H．Regulation of Wnt signaling by protein － protein interaction and post－ translational modifications［J］．Experimental and molecular medicine，2006，38(1):1 －10

5 Behrens J．One hit，two outcomes for VHL － mediated tumorigenesis［J］．Nat Cell Biol，2008，10(10):1127 － 1128

6 Berndt JD，Moon RT，Major MB．β－catenin gets jaded and von Hippel－ Lindau is to blame［J］．Trends Biochem Sci，2009，34(3):101－104

7 Calzada MJ．Von Hippel－ Lindau syndrome:molecular mechanisms of the disease［J］．Clinical and Translational Oncology，2010，12(3):160－165

8 Shiina H，Igawa M，Breault J，et al．The human T－cell factor－4 gene splicing isoforms，Wnt signal pathway，and apoptosis in renal cell carcinoma［J］．Clinical cancer research，2003，9(6):2121 －2132

9 臧桐，庄立岩，张志文，等．β－环连蛋白及其 mRNA在肾癌中的表达［J］．中华医学杂志，2001，114(2):152－154

10 Hemminki K，Jiang Y，Ma X，et al．Molecular epidemiology of VHL gene mutations in renal cell carcinoma patients:relation to dietary and other factors［J］．Carcinogenesis，2002，23(5):809 － 815

11 Pecina－ laus N，Gall－Tro elj K，laus M，et al．Genetic changes of the E－cadherin and APC tumour suppressor genes in clear cell renal cell carcinoma［J］．Pathology，2004，36(2):145 －151