慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞及激活亚群与基因型的分析

章松平 王 莹 陈公英

慢性乙型肝炎患者肝损伤主要是T细胞介导的细胞毒作用或免疫复合物的作用［1］。已有关于不同基因型患者HBeAg、HBV DNA病毒载量以及肝功能指标等关系的研究，但不同基因分型与细胞免疫关系的报道较少［2～4］。本研究通过对175例慢性乙型肝炎患者的血清标本进行基因分型研究，同时检测患者外周血T淋巴细胞及激活亚群的表达情况，旨在探讨CHB患者不同基因型与细胞免疫的关系。

对象与方法

1．研究对象:收集2008年9月～2009年10月杭州市第六人民医院住院治疗的175例慢性乙型肝炎患者，男性116例，女性59例，年龄23～71岁，平均年龄45±7岁。诊断标准依照2000年西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》。所有患者排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及其他病毒感染，入选病例予以核苷类似物(拉米夫定、恩地卡韦或替比夫定)抗病毒治疗。175例慢性乙型肝炎患者中，检测出B型基因型99例，其中HBeAg(－)46例，HBeAg(+)53例(53．5%);C型基因型76例，其中 HBeAg(－)29例，HbeAg(+)47例(61．8%)，具体分布情况见表1。不同基因分型各组的ALT、AST检测结果经统计学分析，各组间差异无统计学意义，见表2。

表1 175例慢性乙型肝炎患者组别情况分布

表2 175例慢性乙型肝炎患者肝功能情况分布

2．基因分型的检测:采用PCR微量板核酸杂交酶联免疫法［5］。

3．血清HBeAg含量的检测:取肘静脉血2ml，分离血清，化学发光法检测患者HBeAg含量，HBeAg含量≤1PEIU/ml为HBeAg阴性;＞1PEIU/ml为HBeAg为阳性。仪器为美国雅培公司生产的ARCHITECT i2000SR化学发光仪，试剂均为配套试剂。

4．外周血T淋巴细胞及激活亚群的表达:取肘静脉血2ml，EDTA－K2抗凝，充分混匀后送检。取6支试管，分别加IgG1－FITC/IgG1－PE/IgG1－PC5、CD4－FITC/CD8－PE/CD3－PC5、IgG1－FITC/IgG1－PE、CD3－FITC/HLA －DR －PE、CD4－FITC/HLA －DR －PE、CD8－FITC/HLA －DR －PE荧光素标记单克隆抗体各20μl，每管加100μl抗凝全血后混匀避光反应15min，在Q－PREP标本处理器(美国Beckman Coulter公司)上溶血、固定、混匀，上流式细胞仪分析 T(CD3+)细胞、CD4+(CD3+CD4+)T细胞、CD8+(CD3+CD8+)T细胞及其激活亚群(HLA－DR+CD3+/CD3+、HLADR+CD4+/CD4+和HLA－DR+CD8+/CD8+)。分析前流式细胞仪处于正常工作状态，且应用Flow－CheckTMFluoropheres(美国Beckman Coulter公司)检测光路流路。同时全血标本上CD3200血细胞计数仪(美国雅培公司)进行血细胞计数分析，得出淋巴细胞绝对值。用淋巴细胞绝对值乘以各亚群细胞百分率，得出各亚群细胞绝对数。

结 果

1．CHB患者外周血T淋巴细胞亚群的表达:175例CHB患者外周血T淋巴细胞亚群的表达，见表3。经统计分析:B型HBeAg(+)组与C型HBeAg(－)组和C型HBeAg(+)组间CD8细胞百分比比较，差异均有统计学意义(t=2．26和 t=2．69，P均 ＜0.05)。4组间淋巴细胞数、CD3和CD4差异均无统计学意义。

表3 不同组别CHB患者外周血T淋巴细胞亚群分布，%)

表3 不同组别CHB患者外周血T淋巴细胞亚群分布，%)

基因分型 HBeAg n 淋巴细胞数CD3 CD4 CD8 B 型 － 46 1541±512 67．90±6．17 35．20±6．67 25．20±6．75+53 1682 ±540 65．8 ±10．4 37．90 ±8．38 23．80 ±5．83 C 型 － 29 1366±256 67．90±8．32 36．40±5．66 28．20±6．33+47 1703 ±509 66．9 ±11．7 34．60 ±7．27 29．90 ±7．32

2．CHB患者外周血T淋巴细胞激活亚群的表达:175例CHB患者外周血T淋巴细胞激活亚群的表达，见表4。经统计分析，4组间T淋巴细胞激活亚群(CD3+HLA－DR+、CD4+HLA－DR+和CD8+HLA－DR+)差异均无统计学意义。

表4 不同组别CHB患者外周血T淋巴细胞激活亚群的分布，%)

表4 不同组别CHB患者外周血T淋巴细胞激活亚群的分布，%)

基因分型 HBeAg n CD3+HLADR+ CD4+HLADR+ CD8+HLADR+ HLADR +B 型 － 46 5．78 ±3．06 2．57 ±1．64 3．07 ±1．34 21．80 ±6．91 53 4．95 ±2．58 2．45 ±1．51 2．52 ±1．75 19．80 ±7．92 C 型 － 29 5．10 ±2．49 3．01 ±1．26 2．64 ±1．73 19．70 ±5．01+47 5．69 ±3．27 3．29 ±1．21 2．43 ±1．41 18．00 ±7．88+

讨 论

HBV基因型有一定的地理分布特征，在我国主要以B型和C型最为常见，不同的基因分型与临床病情轻重存在一定的关系，但与机体的细胞免疫的相关性报道较少［2，6］。本文通过对175例慢性乙型肝炎患者不同基因分型时其外周血T淋巴细胞及激活亚群检测，结果显示:B基因型HBeAg(+)组与C基因型HBeAg(－)组和C基因型HBeAg(+)组间CD8细胞百分比有显著性差异，C型基因型患者CD8细胞高于B型基因型。而各组间CD3、CD4百分比结果比较均没有统计学意义。王敏等［7］动态监测慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后外周血CD8淋巴细胞有升高趋势。有报道［3］基因型和炎症程度差异无统计学意义，但和纤维化程度差异有统计学意义，即基因型C型的纤维化程度比基因型B型的纤维化程度重。提示基因C型比基因B型肝脏组织学易发生纤维组织增生。但HBeAg阴性组和阳性组肝脏病理组织炎症活动度无明显差异［8］。邹怀宾等［4］研究发现，基因B和C型对拉米夫定抗病毒治疗的疗效无影响，基因B型对干扰素α治疗的疗效优于C型。这其中是否具有关联性还有待进一步的探讨。

对175例CHB患者依据B和C基因型分组比较外周血T淋巴细胞激活亚群差异均无统计学意义，先前研究显示［9］，CHB患者外周血T淋巴细胞HLADR抗原表达与不同含量HBV DNA和HBeAg间存在一定的关联性。本研究结果显示CHB患者中基因分型对T淋巴细胞激活状态无明显影响。

综上所述，慢性乙型肝炎患者基因分型与外周血CD8细胞存在一定的关系，但由于本研究本例数较少，且未进行抗病毒治疗前后的对比，因此有待进一步的深入研究。

1 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［J］．中华临床感染病杂志，2010，4(1):1－13

2 许军，王齐欣，蒋栋，等．乙型肝炎病毒基因型与病情轻重的关系［J］．中华肝脏病杂志，2003，13(4):228 －229

3 许家璋，谢琴秀，李平，等．乙型肝炎病毒的基因型和临床病理特征的分析［J］．中华传染病杂志，2006，24(4):270 －272

4 邹怀宾，朱理珉，赵桂鸣，等．e抗原阳性慢性乙肝肝炎患者感染病毒的基因型与抗病毒治疗疗效的关系［J］．中华肝脏病杂志，2007，15(6):425－427

5 陈公英，邵俊斌，徐岱，等．浙江省乙型肝炎病毒B、C基因型感染者临床和肝组织病理的比较［J］．中华传染病杂志，2006，24(2):113－115

6 夏国良，Omana V，贾志远，等．乙型肝炎病毒基因型和血清型在我国部分地区的分布及其特点［J］．中华流行病学杂志，2001，22(5):348－351

7 王敏，张玲霞，罗生强，等．慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后HBV特异性T细胞反应［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2005，19(4):387－390

8 欧晓娟，王晓明，王宝恩，等．e抗原阳性及阴性慢性乙型肝炎患者临床特点比较［J］．中华肝脏病杂志，2007，15(6):428 －430

9 章松平，张永乐，朱明利，等．慢性乙型肝炎T淋巴细胞HLA－DR抗原表达与HBV DNA和HBeAg含量关系的初步分析［J］．中华临床感染病杂志，2010，3(6):333 －336