FOLFOX方案化疗对胃癌术后患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞细胞增殖及功能的影响

蒋 平 唐湘莲 韩绍伟

CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cell，Treg)是表达细胞内转录因子FoxP3(Fork－head box P3)、CD25(IL－2Rα)、CTLA－4和GITR等的CD4+T细胞亚群，其中Foxp3是Treg细胞发育和行使功能的关键分子［1，2］。1995 年 Sakaguchi等［3］发现 Treg细胞在机体免疫稳态维持、肿瘤免疫及移植耐受等方面发挥着重要的作用，但在肿瘤免疫中却通过与效应T细胞的接触抑制或分泌细胞因子抑制抗肿瘤免疫应答，其数量和功能的异常可能对机体造成严重影响。近年来的研究主要集中于Treg细胞发挥肿瘤免疫抑制作用的具体机制，而关于化疗对Treg细胞数量及功能的影响研究较少，只有少数研究局限在单个化疗药物对实验动物或血液病患者的作用上，个别应用在临床晚期实体瘤上［4～10］。本研究以临床胃癌术后患者为对象，应用流式细胞技术和RT－PCR技术，观察FOLFOX方案化疗对患者免疫系统中Treg细胞数量和功能及FoxP3 mRNA表达情况的影响。

材料与方法

1．临床资料:病例选自2009年1～12月间在笔者医院普外科住院的确诊胃癌患者，共43例，包括乳头状腺癌20例，管状腺癌13例，黏液腺癌8例，印戒细胞癌2例;TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例;其中男性27例，女性16例，年龄38～70岁，平均年龄58．9岁，均为行D2胃癌根治术术后，所有研究对象近期内均无急、慢性感染、HIV及病毒性肝炎并且未使用过免疫抑制剂，无自身免疫性疾病史。所有患者均予FOLFOX方案(第1天奥沙利铂130mg/m2+第1～5天5－FU 400mg/m2+第1～5天 CF 200mg/m2化疗，每3周为1个周期。

2．标本采集:所有实验对象于第1次化疗前1天，化疗结束后第5天清晨空腹外周血。

3．主要试剂:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD4和藻红荧光素(PE)标记的鼠抗人 CD25抗体(Biolegend)，F ITC标记小鼠 IgG同型对照及 PE标记小鼠IgG同型对照。淋巴细胞分离液(Sigma公司)。CD4+CD 25+regulatory T cell isolation kit(Miltenyi Biotec公司)、单克隆抗人 CD28抗体(R＆D公司)、LEAF纯化抗人CD3抗体(Biolegend公司)、重组人IL－2(Peprotech EC公司)、［甲基－3－H］胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)(中国科学院上海核技术开发公司)。

4．流式细胞法检测外周血Treg含量:每个样本取100μl抗凝血和20μl CD4(FITC)/CD25(PE)标记抗体加入流式管混匀，室温避光孵育30min;加入红细胞裂解液2ml振荡混匀后避光放置10min至液体透亮;1200g离心5min，2ml PBS重悬后洗涤1遍;再加入0．5ml PBS重悬，流式细胞仪检测(BD公司，FACSCalibur检测)，Cellquest软件数据分析，记录阳性细胞百分率。

5．免疫磁珠分选法(MACS)分离 Treg细胞:取外周血20ml，利用密度梯度离心法，获取PBMCs，利用CD4+CD 25+T细胞磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司)分离细胞，先阴性分选获得CD4+T细胞;再用PE标记抗小鼠CD25单克隆抗体，并以磁珠标记抗PE抗体，经阳性分选获得CD4+CD25+T细胞，阴性分选获得CD4+CD25－T细胞;通过FACS(BD公司，FACSCalibur)分析细胞纯度。

6．RT－PCR法检测Treg细胞表面标志Foxp3 mRNA的表达情况:采取Trizol法提取和纯化各样本细胞总RNA，紫外分光光度计测定纯度、浓度并定量。取2μg总 RNA，按照RT试剂盒说明书进行RT操作程序合成cDNA，然后PCR扩增Foxp3，以 GAPDH为内参照。FoxP3引物上游:5'－GCTGGTCGGGAGAAGAGGA－AAA －3'，下游:5'－CA GTATCCCACGGAAATAACCT－3'，扩增片段大小为433bp;GAPDH引物上游:5'－ATCCCATCACCATCTTCCAG －3'，下游:5'－GAGTCCTTC－CACGATACCAA－3'，扩增片段大小为308bp，反应条件:94℃预变性5min，以94℃变性35s，52℃退火40s，72℃延伸 55s为一个循环，共 35个循环，最后 72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统扫描保存图像，采用Quantity One 4．6．2(BIO－RAD)分析软件，对电泳条带的光密度进行分析，测定各条带的灰度值，通过与内参照的比较计算各样本Foxp3的相对mRNA表达丰度。

7．3H－TdR掺入法检测Treg细胞体外抑制CD4+CD25－T细胞增殖的能力:用小鼠抗人CD3单抗(5μg/ml)包被96孔板，200μl每孔，4℃过夜，PBS洗3遍，然后每孔各加入新鲜分离的Treg细胞及CD4+CD25－T细胞，每组细胞总数1×105个，每组设3个复孔。实验分3组:①单纯Treg细胞组;②Treg细胞:CD4+CD25－T细胞 =1∶1混合培养组;③单纯CD4+CD25－T细胞组。加入小鼠抗人 CD28单抗 (5μg/ml)及10%FCS RPM I－1640作为培养基，每孔终体积 200μl。置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。终止培养前16h，每孔加入最终放射活性为1μCi/孔的3H－TdR(50μl)后继续培养，收集细胞至玻璃纤维滤纸上，37℃孵箱烤干后予液闪计数仪测量，记录每分钟放射计数(CPM)，计算得到抑制率，公式为:抑制率=(l－混合培养组CPM值/单纯CD4+CD25－T细胞培养组CPM值)×100%。

8．统计学方法:采用SPSS16．0统计软件进行分析，主要采用单因素方差分析和LSD－t检验进行样本均数间两两比较，p＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．患者外周血中 Treg细胞的水平:FACS结果示:43胃癌患者化疗前外周血中Treg细胞占淋巴细胞比例为7．57% ±2．91%，占CD4+T细胞的比例为17．63% ±6．31%，化疗后患者Treg细胞占淋巴细胞比例下降至5．21% ±1．69%，占CD4+T细胞的比例下降至13．79% ±4．82%，其差异均具有统计学意义(p＜0．01)，可见化疗后淋巴细胞的减少以Treg细胞尤为显著，导致Treg细胞占CD4+T细胞比例下降，详见表1。

表1 患者化疗前后外周血Treg细胞水平(%，n=43)

2．MACS分离后Treg细胞及CD4+CD25－T细胞纯度:FACS结果显示:MACS法分离各样本Treg细胞及CD4+CD25－T细胞纯度均＞97．5%，化疗前后各细胞纯度差异无统计学意义，对后续实验无明显影响(P ＞0．01)，详见表2。

表2 患者化疗前后外周血Treg细胞水平(%，n=43)

3．FoxP3 mRNA在外周血Treg细胞中的表达:RT－PCR结果显示:32例患者化疗前外周血Treg细胞中 FoxP3 mRNA相对表达水平为 87．32% ±17.24%，化疗后其相对表达水平下降为58．78% ±13．12%，差异具有统计学意义(p＜0．01)，详见图1。

4．Treg细胞对CD4+CD25－T细胞增殖的抑制作用:3H－TdR掺入法检测各样本细胞的增殖情况后结果显示:①化疗后Treg细胞的增殖活性较化疗前明显下降，差异具有统计学意义(p＜0．05);②纯化的Treg细胞可以降低CD4+CD25－T细胞的增殖能力，化疗后其免疫抑制功能较化疗前减弱，差异具有统计学意义(P ＜0．01)，见图2、图3。

图1 患者化疗前后外周血Treg细胞水平FoxP3 mRNA表达情况(n=4)

讨 论

近年来恶性肿瘤患者机体内在的抗肿瘤免疫能力日益受到关注，当前临床胃癌治疗的研究热点已提升到患者免疫功能的改变及其抗肿瘤机制的研究上。临床胃癌常规治疗方法包括根治性切除、化疗等，这些治疗手段同时也可能造成胃癌患者免疫功能的改变。因此通过提高胃癌患者免疫力改善胃癌患者预后从而提高胃癌患者生存质量还值得我们进一步的研究。

Treg细胞是近年来发现的一种具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，与肿瘤的免疫功能抑制密切相关，它们在肿瘤微环境中抑制性调节CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖，抑制免疫调节细胞因子的分泌，降低了肿瘤疫苗或肿瘤抗原多肽激活的树突状细胞所引起的肿瘤免疫反应，从而达到免疫的负性调节作用［11］。化疗作为胃癌术后的重要治疗手段，在一定程度上可以减少术后肿瘤复发转移、改善生活质量并延长患者生存期，但化疗也可能导致机体免疫功能的下降。本研究将观察FOLFOX方案化疗对胃癌患者免疫系统中Treg细胞数量和功能的影响，有助于进一步探讨调节性T细胞在肿瘤免疫耐受中的作用，以及提高肿瘤免疫治疗的效果。

通过流式细胞技术对FOLFOX方案化疗前后胃癌患者外周血中CD4+T细胞、Treg细胞进行检测，本研究发现应用FOLFOX方案化疗5天后患者外周血CD4+T细胞、Treg细胞占外周血单核细胞的比例明显减少，且Treg细胞/CD4+T细胞显著下降，提示FOLFOX方案化疗可降低Treg细胞数量。既往有动物实验［4，5］表明，小鼠体内注射化疗药物环磷酰胺后，Treg细胞绝对数量及其占CD4+T细胞百分率比其他淋巴细胞亚群显著减少、凋亡细胞数明显增加。在临床试验方面，Ghiringhelli等［10］对9个发生转移的实体肿瘤患者低剂量反复给予环磷酰胺后，Treg细胞发生明显的选择性的减少，除环磷酰胺外，蒽环类药物多西紫杉醇，阿糖胞苷类药物氟达拉滨对Treg也起抑制作用［6，7］。这些研究均说明化疗导致的淋巴细胞减少状态下更多地杀伤Treg细胞，导致Treg细胞比例下降，从而使抑制免疫应答的因素减少，有利于诱生抗肿瘤免疫效应。

Foxp3基因又称叉状头/翅膀状螺旋转录因子，Treg细胞的诱导和作用发挥需要Foxp3基因的稳定持续和高水平表达［1，2］。研究表明胃癌患者的外周血Treg细胞中 FoxP3 mRNA呈现高表达，表明在胃癌的发展过程中，转录因子FoxP3能够通过某种机制调控诱导了患者外周血Treg细胞的增殖，并且增强了Treg细胞对自身免疫系统的抑制功能，从而参与机体对肿瘤的免疫耐受［12］。本研究结果发现在化疗前胃癌患者的外周血Treg细胞中FoxP3 mRNA呈现较高表达，应用FOLFOX方案化疗5天后患者FoxP3 mRNA表达水平显著下降，初步说明FOLFOX化疗方案在减少Treg细胞数量的同时可下调其表面标志物FoxP3基因的表达水平，从而可能减弱Treg细胞的免疫抑制功能。Lutsiak、Brode 等［4，5］研究发现，化疗药物环磷酰胺显著减少Treg细胞绝对数量的同时可下调Foxp3的表达量，从而削弱Treg细胞的功能使肿瘤细胞的生长受到抑制。

Treg细胞免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。最初Woo等［13］研究发现Treg细胞可以抑制CD4+CD25－T细胞的增殖。本实验在分离纯化Treg细胞和CD4+CD25－T细胞后将其共同温育，结果发现应用FOLFOX方案化疗5天后患者外周血Treg细胞自身增殖活性较化疗前显著下降，且Treg细胞对CD4+CD25－T细胞的增殖抑制作用显著减弱，表明Treg细胞的免疫抑制功能减弱。此外，Lutsiak、Brode等［4，5］动物实验也表明环磷酰胺可致Treg细胞体外抑制 CD4+CD25－T 细胞增殖能力下降，Beyer等［7］检测73例接受氟达拉滨化疗方案的B细胞慢性淋巴性白血病患者化疗前、后(化疗后第7天)的外周血，结果显示化疗后，Treg细胞数目明显减少，Treg细胞抑制功能减弱甚至消失。

化疗作为一种重要的治疗肿瘤的手段，对Treg细胞产生的影响尚无统一的意见。本实验初步表明FOLFOX方案化疗可下调Treg细胞数量且可减弱其免疫抑制功能，从而增强机体抗肿瘤免疫效应，为肿瘤的化疗免疫治疗提供了一种新的思路。目前，关于各种化疗药物对Treg细胞的影响以及化疗药物在第几个周期后发挥明显作用的研究还不多，对于各种化疗药物对Treg细胞作用的机制更知之甚少，还有待于进一步研究。

1 Williams LM，Rudensky AY．Maintenance of the Foxp3－dependent develop－mental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3［J］．Nat Immunol，2007，8(3):277 －284

2 Wan YY，Flavell RA．Regulatory T－cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression［J］．Nature，2007，445(7129):766－770

3 Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al．Immunologic self－tolerance maintained by activated T cells expressing IL－2 receptor alpha－chains(CD25)．Break down 0f a single mechanism of self－tolerance causes various autoimmune diseases［J］．Immunol，1995，155(3):1151－1164

4 Lutsiak MEC，Semnani RT，Pascalis RD，et al．Inhibition of CD4+CD25+T regulatory cell function imp licated in enhanced immune response by low －dose cyclyphosphamide［J］．Blood，2005，105(7):2862－2868

5 Brode S，Raine T，Zaccone P，et al．Cyclophosphamide － induced type－1 diabetes in the nod mouse is associated with a reduction of CD4+CD25+foxp3+regulatory T cells［J］．Immunol，2006，177(10):6603－6612

6 Chu Y，Wang LX，Yang G，et al．Efficacy of GM－CSF－producing tumor vaccine after docetaxel chemotherapy in mice bearing established Lewis lung carcinoma［J］．Immunother，2006，29(4):367 －380

7 Beyer M，Kochanek M，Darabi K，et al．Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine［J］．Blood，2005，106(6):2018－2025

8 Lopez M，Aguilera R，Perez C，et al．The role of regulatory T lymphocytes in the induced immune response mediated by biological vaccines［J］．Immunobiology，2006，211(1 －2):127 －136

9 王建，李慧，曹作荣．手术及化疗对卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性 T细胞比例的影响［T］．天津医科大学学报，2007，13(2):217－220

10 Ghiringhelli F，Menard C，Puig PE，et al．Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients［J］．Cancer Immunol Immunother，2007，56(5):641 －648

11 Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al．Immunologic tolerance maintained by CD4+CD25+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance［J］．Immunol Rev，2001，182:18 － 32

12 Iiizumi M，Bandyopadhyay S，Watabe K．Interaction of Duffy antigen receptor for chemokines and KAI1:a critical step in metastasis suppression［J］．Cancer Res，2007，67(4):1411 －1414

13 Woo EY，Yeh H，Chu CS，et al．Cutting edge:regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cel proliferation［J］．Immunol，2002，168(9):4272－4276