二氯化钴诱导A549细胞凋亡及机制的研究

陈 健 仇 容 毕艳丽 徐麟皓 沈香娣

缺氧是实体肿瘤的主要生长特性之一，与肿瘤的凋亡抑制、放化疗耐受、血管生成和侵袭转移等关系密切［1］。也有研究表明缺氧可以通过抑制线粒体呼吸链、降低线粒体膜电位，增加活性氧的生成以及通过JNK/SAPK等信号途径诱导凋亡［2］。本实验从缺氧对人非小细胞肺癌A549体外毒性试验，并对细胞传导通路的相关分子进行研究，探讨缺氧诱导肺癌细胞凋亡的分子机制。

材料与方法

1．细胞来源和培养:人非小细胞肺癌A549细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司。细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，培养液为含有10%小牛血清的RPMI1640，每2～3天传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

2．药物和试剂:二氯化钴(CoCl2)购自美国 Sigma公司;RPMI1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司;小牛血清购自杭州四季青生物制品公司;MTT、DMSO均为美国MBI公司产品;荧光染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;一抗(survivin、Akt和p－Akt抗体购自美国CST公司;β－actin购自美国 Santa Cruz公司)，二抗(survivin、Akt、p－Akt和β－actin均购自美国Pierce公司)。

3．MTT法检测细胞生长抑制率:用培养液稀释配成不同浓度 CoCl2(100、200、300、400μmol/L)。以约 2．0 ×104个/孔细胞接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后弃去旧培养液，分别加入不同浓度CoCl2，每个浓度每个时间点均设6个平行孔，并设细胞对照组，细胞对照组加入无血清培养液，培养24、36和48h。采用MTT法检测，弃去培养液，加入5g/L的MTT溶液20微升/孔，继续培养4h，然后吸弃上清液，加150微升/孔DMSO，振荡10min后用酶标仪测每孔A490nm值，计算细胞生长抑制率(IR)。细胞生长抑制率=［1－(A药物处理组/A细胞对照组)］×100%。实验重复3次，取平均值。

4．AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡:以约1．0×106个/孔细胞接种于6孔培养板中，待贴壁后弃去旧培养液，分别加入不同浓度的CoCl2(200、300、400μmol/L)，并设细胞对照组，培养24、48h，用PBS洗涤并配成5．0×105个/ml细胞悬液，将25μl细胞悬液和染色反应液混合，吸取10μl混合液置于一载玻片，并用盖玻片盖上，在荧光显微镜510nm激发波长下观察细胞。计数500个细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=［(凋亡早期细胞+凋亡晚期细胞)/细胞总数］×100%。实验重复3次，取平均值。

5．Western blotting检测蛋白表达:实验组分别用不同浓度(200、300、400μmol/L)CoCl2培养 24h 及 300μmol/L CoCl2作用24、36、48h，并设细胞对照组，收集各组细胞。PBS洗涤2次，加入蛋白裂解液，置冰上30～60min。12000r/min离心15min，取上清液，采用BCA法进行总蛋白定量，然后上样，电泳，转膜，封闭，加一抗，4℃孵育过夜，TBS－T洗膜3次，二抗孵育2h，洗膜3次，加入ECL，暗盒中曝光后进行显影和定影。应用凝胶扫描仪对胶片进行光密度扫描，并以β－actin校正做相对量分析，数值以两者积分光密度的比值表示。实验重复3次，取平均值。

结 果

1．细胞增殖的检测结果:300、400μmol/L CoCl2作用24、36、48h后A549细胞的生长受到不同程度的抑制，与对照组比较有显著差异(p＜0．01)，并呈比较明显的剂量和时间依赖关系，400μmol/L 48h后细胞抑制率可达79．03%(表1)。

表1 不同浓度CoCl2作用不同时间对细胞生长的影响，n=3)

与对照组比较，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

组别 24h A490值 IR(%) 36h A490值 IR(%) 48h A490值 IR(%)0．62 ±0．03 － 0．60 ±0．03 － 0．62 ±0．06 －2(100μmol/L) 0．73 ±0．07 －17．74 0．76 ±0．05 －26．67 0．56 ±0．05 9．68 3(200μmol/L) 0．61 ±0．04 1．61 0．55 ±0．09 8．33 0．42 ±0．02* 32．26 4(300μmol/L) 0．38 ±0．01＊＊ 38．71 0．38 ±0．01* 36．67 0．32 ±0．06＊＊ 48．39 5(400μmol/L) 0．31 ±0．02＊＊ 50．00 0．22 ±0．06＊＊ 63．33 0．13 ±0．05＊＊1(对照组)79．03

2．凋亡细胞的检测结果:通过荧光显微镜下观察到凋亡早期细胞形状不规则，如呈新月形，核质体呈绿色;凋亡晚期细胞大小不一，可见胞质芽状突起，核质体呈橙色，染色质浓缩，见图 1。200、300、400μmol/L CoCl2处理24、48h后的细胞凋亡率均显著高于对照组(p＜0．01)(表2)。

表2 不同浓度CoCl2作用不同时间对细胞凋亡的影响(n=3

表2 不同浓度CoCl2作用不同时间对细胞凋亡的影响(n=3

与对照组比较，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

组别 组别(μmol/L)细胞凋亡率(%)(24h)细胞凋亡率(%)(48h)2．23 ±0．41 2．55 ±0．48 CoCl2 组 200 9．34 ±0．87* 12．13 ±1．61＊＊300 12．93 ±1．50＊＊ 21．25 ±3．52＊＊400 19．17 ±2．93＊＊ 26．09 ±1．80对照组 －＊＊

3．total－Akt、p－Akt及 survivin 蛋白表达的检测结果:300、400μmol/L CoCl2作用 48h 后 p －Akt、survivin蛋白表达量较对照组显著减少(p＜0．01)，300μmol/L CoCl2作用36、48h较对照组能显著下调p－Akt、survivin蛋白表达量(P ＜0．01)，而 total－Akt蛋白表达量均无显著变化。结果见图2、图3，表3、表4。

图2 不同浓度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达

表3 不同浓度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达(n=3)

表3 不同浓度CoCl2作用48h后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达(n=3)

与对照组比较，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

－ 0．20 ±0．01 0．39 ±0．03 0．46 ±0．03 CoCl2 组 200 0．22 ±0．02 0．38 ±0．02 0．40 ±0．02 300 0．20 ±0．03 0．28 ±0．01* 0．30 ±0．03＊＊400 0．19 ±0．02 0．14 ±0．03＊＊0．11 ±0．03 total－Akt p－Akt survivin对照组组别(μmol/L)＊＊

图3 400μmol/L CoCl2作用不同时间后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达

表4 400μmol/L CoCl2作用不同时间后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达(n=3

表4 400μmol/L CoCl2作用不同时间后total－Akt、p－Akt及survivin蛋白表达(n=3

与对照组比较，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．001

－ 0．21 ±0．03 0．37 ±0．04 0．38 ±0．03 CoCl2 组 24h 0．22 ±0．05 0．26 ±0．02* 0．34 ±0．03 36h 0．20 ±0．02 0．20 ±0．03＊＊ 0．22 ±0．02＊＊48h 0．17 ±0．04 0．15 ±0．02＊＊ 0．15 ±0．02 Total－Akt p－Akt survivin对照组分组＊＊

讨 论

正常氧供给条件下，钴通过细胞内离子置换使亚铁螯合酶失活，抑制细胞氧化反应，从而达到常氧下模拟细胞缺氧的目的。我们采用CoCl2处理A549细胞，模拟体外细胞化学性缺氧进行实验。应用MTT法和细胞形态学检测证实CoCl2对A549细胞具有明显的毒性作用，且呈剂量－时间依赖性地增加细胞生长抑制率并诱导其凋亡，400μmol/L作用48h细胞生长抑制率高达79%，细胞凋亡率高达26%。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它处在多条信号通路的重要交叉点，在细胞的存活和介导肿瘤的发生中有重要作用，并且已经成为肿瘤治疗的新靶点之一［3］。p－Akt是AKT的功能活化状态，在大部分肿瘤中高表达，其活化过程可分为PI3K依赖和非PI3K依赖两种。磷脂酰肌醇－3激酶(PI3K)是细胞内磷脂的关键调节剂，Akt处在PI3K/Akt信号通路的中心环节，是PI3K下游的直接靶蛋白，Akt催化结构域的Thr308及Ser473位点的磷酸化而被激活，成为p－Akt［4］，只有 p－AKT 才具有生物学特性。本实验Western blotting法检测了CoCl2处理前后的Akt、p－Akt蛋白表达变化，结果显示p－AkT蛋白表达量比对照组下降，统计学有显著性差异，且呈剂量－时间依赖性，而总AKT蛋白改变无显著性差异，说明p－AkT是细胞内早反应事件，证实该信号通路被化学性缺氧阻断。p－AkT抑制细胞凋亡与其能够磷酸化激活下游一系列分子如Bcl－2家族、Foxo家族、lAPs家族、半胱氨酸蛋白酶(caspase)－3、caspase－9、Bad、NF － κB 等成员有关，保护细胞不发生凋亡［5～8］。

经典的凋亡通路有死亡受体通路和线粒体通路，最后都激活天冬氨酸特异性caspase家族导致凋亡的发生，而凋亡抑制蛋白(IAPs)家族起抑制凋亡的作用［9］。survivin是IAPs家族的一个新成员，是目前发现最强的凋亡抑制因子。研究证实，它在肺癌组织中表达高达90%，并且是非小细胞肺癌最显著的预后影响因子之一［10］。survivin的高表达可抑制 Fas、Bax、caspase以及抗肿瘤药物等多种因素所诱导的细胞凋亡。本实验检测结果显示，CoCl2处理后的survivin蛋白表达水平显著下降，并呈剂量－时间依赖性，促进细胞凋亡的发生。而且本研究也探讨了p－Akt和survivin的关系，结果表明p－Akt和 survivin表达呈正相关，提示在A549细胞中survivin的高表达可能与Akt的活化有关。Fornaro等在前列腺癌细胞及CD34+的脐血细胞中也证实了存在Akt/survivin通路。

基于以上实验结果可证实，CoCl2诱导A549细胞凋亡与阻断Akt信号转导通路，下调survivin表达发病机制占有重要地位，但细胞凋亡过程是多系统、多因素参与的复杂过程，是否还有其他机制的参与，具体的机制尚有待进一步实验研究证实。

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5 Fayard E，Gill J，Paolino M，et al．Deletion of PKB alpha/Akt1 affects thymic development［J］．PLoSOne，2007，2(10):992

6 Matter M，Ruoslahti E．A signaling pathway from the alpha5betal and alpha(v)beta3 integrins that elevates Bcl－2 transcription［J］．J Biol Chem，2001，276(30):27757 －27763

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