CACNB2基因多态性与钙离子通道阻滞剂降压疗效的相关性研究

李清贤 孙 倩 宋喜发 唐疾飞 王尧杰 牛宇欣 包其郁 张国强 胡云良

原发性高血压是一种多基因遗传性疾病，由多对等位基因(共显性基因)控制，并受环境因素影响，是心脑血管疾病的主要危险因素。钙离子拮抗剂(CCB)作为临床治疗高血压病的一线药物，是一种公认的有效抗高血压药和动脉扩张药，它通过阻滞Ca2+进入细胞内特异性L型Ca2+通道而发挥作用［1］。但不同EH患者群体及个体对CCB呈现不同的降压反应，推测可能与遗传素质的不同有关［2］，本实验选取CACNB2的6个SNP位点，选择服用单一钙离子通道阻滞剂(CCB)的EH患者进行临床跟踪随访观察疗效，旨在探讨CACNB2基因多态性与CCB降压疗效的相关性。

对象与方法

1．实验对象:于温州医学院附属第二医院、鹿城区人民医院以及温州市部分街道卫生服务中心，随机选取104名EH患者，按照2004年《中国高血压防治指南》高血压诊断标准:未治疗前非同日3次测量，收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg者，或者血压＜140/90mmHg，但正在服用降压药者。男性60例，女性44例，平均年龄47．39±9．42岁。并排除继发性高血压、糖尿病、活动性甲状腺功能亢进、贫血、周围血管疾病、大动脉炎、先天性血管畸形，排除不适合服用CCB患者。且所有研究对象签署知情同意书入选。

2．研究方法:(1)用药方法:对诊断发现的原发性高血压病例服用纳欣同(浙江泰利森药业有限公司生产，批号:090404)20mg，每日1次。之前正在服用其他降压药物治疗的病例需在入选后停用原降压药物2周之后服用纳欣同。在每一天的同一时间段服用，期间不用其他任何影响血压的药物。(2)观察指标:服药前及服药后的第2、4、6周末各随访1次，按照血压测量的标准方法由专人在固定时间段测量血压值，并做以记录。(3)疗效判断标准:治疗6周末，收缩压降低值大于等于20mmHg，舒张压降低值大于等于10mmHg，或者未达到上述标准，但是降至正常范围，均视为治疗有效。(4)标本的采集:治疗前空腹抽取静脉血5ml，2ml入EDTA抗凝管中，－70℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA，3ml用于分离血清检测血脂、血糖、肝肾功能等生化指标。

3．基因扩增及分型:(1)仪器与试剂:Applied Biosystems公司的GeneAMPPCR System9700;MassARRAY Compact System;人血全基因组DNA抽提试剂盒购血AXYGEN公司，多重PCR引物及延伸引物由SEQUENOM公司Assay Design3．1程序进行设计由北京擎科公司合成，PCR引物及延伸引物序列(表1)。(2)PCR及SNP分型:利用多重PCR技术对目的序列进行扩增，采用多重PCR技术对所选的6个包括SNP位点在内的基因序列进行扩增。(按800个标本配制PCR反应Mix，加入6对引物，每一个标本对应的孔反应体系:总体系5μl中含:10ng/μl的 DNA 2μl;Buffer 0．5μl;25mmol/L MgCl20．4μl;25mmol/L dNTPMix 0．1μl;0．5μmol/L Primer Mix 1μl，5U/μl PCR Enzyme 0．2μl，剩余加去离子水 0．8μl至 5μl。反应条件:95℃预变性2min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环，最后72℃延伸5min)在上述PCR扩增产物中加入ddNTP，通过单碱基延伸只能延伸一个碱基(约20bp)对目的SNP位点进行延伸(反应体系:iPLEX GOLDBuffer 0.2μl;iPLEX Termination mix 0.2μl;iPLEX Enzyme 0.041μl;iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl;iPLEX GOLD Buffer 0.2μl;Nanopure water 0．619μl;共 2μl加入至上一步的体系中共9μl，反应条件:①94℃预变性 30s;②94℃变性5s;③52℃退火5s;④80℃延伸5s;③④循环5次;然后②③④循环40次;⑤94℃ 延伸5s。)产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－TOF MS)基因分型技术，进行SNP分型。

表1 CACNB2基因6个SNP位点的PCR延物及单碱基延伸产物设计

4．统计学方法:应用SPSS 16．0统计分析软件，群体代表性检验采用Hardy－Weinberg平衡法;概率用P表示，p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．质谱分析结果:根据单碱基延伸产物分子质量不同确定其基因型，经MALD1－TOF检测分析，在6个位点中，除rs7069292在人群中只发现两种基因型TT和CT，其余5个位点均发现3种基因型均可得到3种质谱图形(两种纯合型和一种杂合型)单峰为纯合型，双峰为杂合型。以rs10764319 C/T多态性的质谱图为例作说明(图1)。

图1 rs10764319 C/T多态性的质谱图

2．群体代表性检验:高血压患者和血压正常者CACNB2基因的6个SNP位点基因型分布经χ2检验，P＞0．05，符合 Hardy－Weinberg平衡，表明研究对象来自同一群体具有群体代表性。

3．服用钙拮抗剂者各个位点不同基因型疗效的差异(104例):对服用单一钙拮抗剂随访6周到底的104例EH病例进行病例自身对照研究，经R×C表卡方检验和四格表卡方检验，结果显示，rs11014166 SNP携带AA基因型的病例对钙拮抗剂有效率显著高于AT+TT基因型携带者的有效率，统计学意义差异显著(p＜0．05)，其余5个位点各基因型之间均无统计学意义(P均＞0．05)(表2)。

讨 论

钙离子通道分为三型:L型、N型、T型，其中L型最重要，主要分布在血管平滑肌和心肌，L型电压依赖性钙离子通道(L－VDDC)包括α1、α2δ和β亚单位。其中α1亚基最重要，由它组成亲水孔道调控Ca2+内流。Ca通道药理学、电生理学的差异主要取决于α1亚基的种类［3］。相关动物实验研究表明，人为地使机体动脉血压升高，可使α1C亚基上调，钙离子通道数目增多，提示血压与钙离子通道数目也呈正相关［4］。辅助亚基β2(CACNB2)编码电压门控离子通道β2亚基，定位于染色体10p12［5］。主要通过与α 亚基结合调节 L－VDDC 活性［6～10］。改变 Ca2+内流的数量，影响α1亚基的功能。α1亚基在高血压时表达增加，使钙通道数量增多，从而加速高血压的发展，故能使α1C亚基数目恢复正常的药物，有望用于临床治疗高血压。钙离子拮抗剂通过与钙离子通道靶位点结合，抑制钙离子通道活性，从而抑制钙离子从膜外向膜内内流，降低细胞收缩，导致血管扩张，从而达到降低血压的目的。

表2 服用钙拮抗剂者各位点不同基因型疗效的差异(n=104)

我们的研究通过对104例随访6周观测血压变化的EH病例进行CACNB2基因型高血压关系分析，结果发现rs11014166携带AA基因型钙拮抗剂有效率显著高于AT+TT基因型携带者，统计学差异显著(p＜0．05)，rs11014166的基因AA基因型对钙拮抗剂比较敏感，降压效果较其他两种基因型明显，推测rs11014166位点多态性可能影响钙拮抗剂对EH疗效，该位点位于内含子区域，推测可能通过影响转录过程，影响到基因的表达改变，进而影响蛋白质的功能，导致β2与α1亚基结合改变，致使L－VDCC活性改变，从而导致血压的变化。我们可以推测，CACNB2多态性位点的突变，可能会通过影响CACNA1C的功能调节，或直接影响L－VDCC的功能，进而影响到其与靶位点结合，导致钙拮抗剂药物疗效出现差异。另外近来药物学方面的研究，设计出的一种变异的β亚基，通过它影响α1C亚基，进而影响钙离子通道数目减少钙离子的内流，影响兴奋收缩偶联。其利用Ca2+v1．2的变异，或利用变异的β或α2δ亚基，后两亚基自身结构改变或者与α1亚基结合改变影响其对血管上的α1C亚基的调节，间接的特异的减少血管上L型钙通道的数量，设计出新型的降压药物［11］。其余5个SNP位点治疗疗效在每个位点的不同基因型间的差异无统计学差异，可能是因为样本量少，抽样误差造成，同时部分位点的部分基因样本含量太少，或许并不能真实反应相应携带者的实际药物反应水平，还需进一步扩大样本量，做进一步的研究来验证。

本研究首次在国内探讨了钙离子通道辅助亚基CACNB2多态性对钙拮抗剂治疗EH患者疗效差异，为EH临床个体化有效用药提供药物遗传学依据。

1 Znirten V．原发性高血压药物治疗的新进展［J］．高血压杂志，2002，10(5):405

2 Lifton RP．Genetic determinant of human hypertension［J］．Prroc Natl Cad Sci USA，1995，92(19):8545 －8451

3 张朝，翟溯澜．心肌细胞L型钙离子通道分子结构与疾病［J］．河南大学学报(医学版)，2007，26(3):1 －6

4 薛全福，王振纲．钙通道不同分型与亚基和抗高血压药物的关系［J］．中国药理学通报，2008，24(5):569 －572

5 Ebert AM，McAnelly CA，Srinivasan A，et al．The calcium channel β2(CACNB2)subunit repertoire in teleosts［J］．BMCMolecular Biology，2008，9:38

6 Varadi G，Lory P，Schultz D，et al．Acceleration of activation and inactivation by theβsubnit of the skeletal muscle calcium channel［J］．Nature，1991，352:159 －162

7 Lory P，Varadi G．Schwartz A．Theβ subunit controls the gating and dihydropyridine sensitivity of the skeletal muscle Ca2+channel［J］．Biophys J，1992，63:1421 －1424

8 Kldckner U，Itagaki K，Bodi I，et al．β subunit expression is required for cAMP－dependent increase of cloned cardiac and vascular calcium channel currents［J］．Pflagers Arch，1992，420:413 －415

9 Singer D，Biel M，Lotan I，et al．The roles of the subunits in the function of the calcium channel［J］．Science，1991，253:1553 － 1557

10 Wei X，Perez－Reyes E，Lacerda AE，et al．Heterologous regulation of the cardiac Ca2+channel，subunit by skeletal muscle β andγsubunits［J］．JBiol Chem，1991，266:21943 －21947

11 Sonkusare S，Palade PT，Marsh JD，et al．Vascular calcium channels and high blood pressure:pathophysiology and therpeutic implications［J］．Vascul phamacol，2006，44(3):131 －142