血浆一氧化氮水平与支气管哮喘的相关性研究*

陈嘉馨 陆家政 黎惠贞 吴荣华 杜一凡 麦燕瑜 臧林泉

器官和细胞功能是在无数信号分子，包括脂质、肽、有机和无机分子、代谢中间物等作用下实现的，气体信号分子作为其中的成员对器官和细胞功能的维持起重要作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一种信号分子，又是一种细胞毒性分子，调节体内一系列生理病理过程，包括血管舒张、抑制血小板在内皮细胞表面粘附与血小板凝集、神经传递、宿主防御和细胞毒作用等，并在一定条件下参与组织炎症及损伤，参与多种疾病的病理生理过程[1]。研究发现，在哮喘患者气道上皮细胞中NO的表达增加，其作为一种效应分子，能参与炎症与组织损伤修复，过量的NO能扩张血管，促进炎症细胞渗出及炎症介质释放，被认为是哮喘炎症反应的前介质，NO在哮喘的发病机制中起着非常重要的作用[2]。本实验观察不同时期哮喘患者和健康人之间血浆NO水平的差异及其相关性，从新的角度探讨哮喘的病因及防治。

1 资料与方法

1.1 一般资料 70例哮喘患者，诊断标准、急性发作期分级及缓解期的判断符合2006年哮喘全球倡议(global initiative for asthma，GNA)标准[3]：气道可逆试验阳性系指吸入支气管扩张剂第1秒用力呼气容积(force expiration volume in one second，FEV1.0)增加15%以上且其绝对值增加200 ml以上；缓解期系指经过治疗，患者症状、体征消失，肺功能恢复到急性发作前水平。其中哮喘急性发作期40例，男性21例，女性19例，平均年龄(43.1±5.1)岁；临床缓解期30例，男性14例，女性16例，平均年龄(40.5±6.3)岁；健康对照组15例，男性8例，女性7例，平均年龄(30.5±4.6)岁，无呼吸道症状及心肺等疾患。性别情况各组的差异无统计学意义(P>0.05)，年龄情况各组的差异有统计学意义(P<0.01)。所有研究对象均为非吸烟者，均获知情同意并签署知情同意书。NO测定试剂盒(Bioting-Tech公司)，亚乙烯二胺(sigma 公司)，其余试剂为国产，分析纯。

1.2 方法

1.2.1 肺功能测定 所有对象入选时采用肺活量计法测定第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1.0%百分比)、FEV1.0/FVC及呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

1.2.2 血浆一氧化氮水平测定 血浆NO含量的间接测定，硝酸还原酶测定法。因NO化学性质活泼，半衰期极短，迅速与分子氧反应生成NO2-和NO3-，故以血浆NO2-和NO3-之和检测NO的相对含量，应用Bioting-Tech公司提供的NO测定试剂盒，采用硝酸还原酶特异性地将NO3-还原为NO2-，NO2-与显色剂亚乙烯二胺作用，生成粉红色偶氮化合物，通过比色测出NO2-/NO3-含量[4]。

1.2.3 诱导痰细胞计数分类 参照文献[5]报道的方法进行：受试者测试肺功能FEV1.0>FEV1.0pre的60%，可以进行痰液诱导，试验前受试者漱口后，吸入沙丁胺醇(万托林)400 μg，15 min后开始超声雾化吸入4%(质量分数)的高渗盐水40 ml，20～40 min后收集痰液，加入等量0.1%(质量分数)二硫苏糖醇(DTT)溶液，振荡至痰液完全均匀化开，取50 μl痰液注入细胞池作细胞计数，其余痰液在常温下3500 r/min离心10 min，取上清液分装，-80 ℃保存待测。离心沉渣涂片行瑞氏-吉姆萨染色作细胞分类计数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，数据以()表示，两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析(F检验)，采用Pearson相关分析计算相关系数，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 正常对照组FEV1.0%预计值为(89.7±6.5)，FEV1.0/FVC 值为 (81.7±8.5)，PEF%预计值 (95.7±13.5)；哮喘缓解期组FEV1.0%预计值为(67.7±5.5)，FEV1.0/FVC值为(65.7±3.5)，PEF%预计值(69.8±19.5)；轻度急性发作期组FEV1.0%预计值为 (58.7±7.2)，FEV1.0/FVC 值为 (59.6±7.5)，PEF%预计值(57.6±18.5)；中度急性发作期组FEV1.0%预计 值 为 (50.7±4.9)，FEV1.0/FVC 值 为 (52.8±5.3)，PEF%预计值(49.8±20.5)；重度急性发作期组FEV1.0%预计值为 (40.7±4.8)，FEV1.0/FVC 值 为 (48.8±7.8)，PEF% 预 计 值(40.3±21.6)。各组的FEV1.0%预计值、FEV1.0/FVC值及PEF%预计值比较差异均有统计学意义(F值分别为23.132、25.012、21.025，P<0.01)。

2.2 血浆NO比较 健康对照组的血浆NO水平为(43.28±4.06)μmol/L，哮喘临床缓解组为(56.30±3.07)μmol/L，急性发作期轻度组为(65.57±2.38)μmol/L，中度组为(71.73±6.08)μmol/L，重度组为(87.36±7.15)μmol/L，各组比较差异均有统计学意义 (F=23.5，P<0.101)。

2.3 诱导痰细胞计数分类 诱导痰细胞总数、中性粒细胞百分比、巨噬细胞百分比及嗜酸性粒细胞百分比在各组之间的比较差异均有统计学意义(F值分别为8.753、21.856、32.526、19.827，P<0.01)，诱导痰淋巴细胞百分比在各组之间差异无统计学意义(F=0.461，P>0.05)。见表1。

表1 各组诱导痰细胞总数及分类计数()

表1 各组诱导痰细胞总数及分类计数()

*与正常对照组相比，P<0.01；#与哮喘缓解期相比，P<0.01

正常对照组(n=15) 3.9±1.7 22.0±1.6 63.2±2.1 0.12±0.12 11.2±1.4哮喘缓解期(n=30) 6.8±2.9* 28.8±5.7*45.5±6.3* 8.9±3.6*13.3±5.3轻度急性发作期组(n=10)13.5±6.7*#37.8±2.8*#37.8±6.3*#10.3±2.7*13.8±2.9中度急性发作期组(n=12)16.9±3.6*#42.6±2.3*#30.6±5.7*#11.6±4.1*#12.9±8.6重度急性发作期组(n=18)20.7±4.1*#46.2±7.4*#25.7±5.7*#13.6±5.4*#13.1±3.7 F值 8.753 21.856 32.526 19.827 0.461 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05

2.4 相关性分析 研究对象所处的状态(健康、哮喘缓解期及哮喘发作期)与血浆一氧化氮水平明显相关(r=0.786，P<0.01)。急性发作期患者血浆一氧化氮水平与FEV1.0%预计值呈负相关(r=-0.872，P<0.01)，与诱导痰细胞总数、中性粒细胞百分比及诱导痰嗜酸细胞百分比呈正相关(r分别为0.857、0.816和0.825，P<0.01)，与诱导痰巨噬细胞百分比呈负相关 (r=-0.820，P<0.01)。

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)的发作是由于炎性细胞及某些结构性细胞释放的多种细胞因子和趋化因子组成的复杂网络，主要包括气道炎症、免疫与变态反应、气道神经调节以及遗传机制等，在内外因素的作用下，发生调控异常，导致炎症-上皮细胞-气道重塑-炎症加重的恶性循环，牵涉多种炎症介质及细胞因子。目前，合适的哮喘标志物及气道炎症介质的测定成为哮喘气道炎症研究新的热点课题。

本研究表明，支气管哮喘组的血浆一氧化氮水平显著高于正常对照组，其中急性发作期组显著高于缓解期组，急性发作期组中轻度、中度、重度三者之间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。线性相关性分析显示，一氧化氮水平与支气管哮喘发作有相关性。与罗春玲[6]报道的一致。Ward等[7]通过实验发现，NO供体可明显抑制乙酰胆碱、组胺、白三烯D4所致的气道收缩，NOS抑制剂L-NAME可以减弱由于干冷空气、运动所引起的气道收缩，但不影响乙酰胆碱释放，提示NO有对抗乙酰胆碱收缩气道平滑肌的作用，cNOS来源的NO可以松弛气道平滑肌，对气道平滑肌调节发挥作用；但哮喘发作时，cNOS来源的NO生成减少，气道非肾上腺素能非胆碱能神经功能发挥不足，而iNOS活性大大增强导致局部NO大量产生，当体内持续大量合成NO，在发挥免疫效应的同时也造成局部组织损伤。NO造成气道损伤的机理为，直接损伤气道组织细胞的DNA、线粒体及含铁酶类的活性，在气道内的特殊化学环境中和O2-形成过氧化亚硝酸(ONOO-)，与其他氮氧化物相互转变，形成NO2等高毒性物质。血浆中大量的NO更多表现为细胞毒性作用，致毛细血管后微静脉渗出增多，加重肺通气/血流比例失调及加重支气管痉挛。

哮喘时，嗜酸性粒细胞会显著的升高已被公认，并与哮喘严重程度成正相关；它主要通过释放胞质中的主要碱基蛋白(MBP)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞衍生性神经毒素(EDN)等毒性颗粒蛋白损伤靶器官，这些颗粒蛋白是造成哮喘特征性表现的主要原因之一[8]。哮喘气道炎症时，嗜酸性粒细胞释放NO的同时又促进嗜酸细胞的趋化，并抑制其凋亡，提示NO在哮喘嗜酸性粒细胞炎症中起着放大作用[9]。

近年来的研究发现，在重度哮喘患者的气道组织、支气管肺泡灌洗液和痰液中中性粒细胞增多，它主要是其激活后释放IL-8、氧自由基(O2-)、胰肽酶等介质，对肺组织造成损伤，从而在哮喘的发生发展中发挥重要的作用[10]。NO主要存在中心粒细胞的胞浆中，当中心粒细胞被激活时，分泌到细胞外并随病情的严重程度而增加[11]，它主要引起肺基底膜的降解、黏液腺过度增生、黏液过度分泌、上皮细胞损伤等，在哮喘患者大量的黏液栓形成中起着重要作用。另外，NO还能刺激IL-8的产生，促进中心粒细胞的聚集，加重气道炎症。

本研究结果表明，随着哮喘的严重程度，诱导痰细胞总数及中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比升高，血浆一氧化氮水平明显升高，提示NO可能通过上述途径参与哮喘的慢性气道炎症过程，但仍需对此进行深入研究。

本研究作为支气管哮喘发病机制的探究，尚有较多的局限性，认为一氧化氮的表达增高是导致哮喘炎症改变的形成和进展的重要原因之一，将为下一步研究如何增加cNOS的活性和/或选择性iNOS抑制剂的作用提供依据，可能为哮喘的治疗提供一个新的突破点。

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