马蹄皮总提取物多组分的协同抗氧化能力研究

黄华，林庆宇，罗杨合，张志，陈振林

（贺州学院，广西 贺州 542800）

活性氧自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类具有高度氧化活性的物质，其化学性质相当活跃，易对组织细胞造成损伤，引起机体衰老，诱发肿瘤等恶性疾病[1]。食用抗氧化性食品对抑制因活性氧自由基引起的心血管等疾病具有一定作用，但是，目前广泛被应用的食品抗氧化剂大多属人工合成，其安全可靠性不足[2]。因此研究抗氧化剂的抗氧化能力和抗氧化过程，开发合成抗氧化剂的替代物质显得极为重要。从天然植物的不同部位中提取具有抗氧化能力的物质[3-5]，已被认为是寻求安全可靠天然抗氧化剂的一种有效方式。

马蹄皮作为马蹄加工过程中所产生的废料，在对其前期的研究中发现其含有丰富的黄酮和色素[6-7]，并确定了其抗氧化性能[8-9]。但研究者多将注意力放在单一成分上，关于马蹄皮总提取物的组成及协同抗氧化性能的研究鲜见报道。本文利用乙醇、甲醇、水、乙酸乙酯4种试剂，研究了不同溶剂提取物的还原能力及对DPPH和羟自由基的清除能力，研究不同溶剂提取物的抗氧化能力差异的同时，确定了马蹄皮提取物中多组分可能存在的协同作用，以利于进一步开发利用马蹄皮资源。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜马蹄皮剔除腐烂部分，用自来水清洗去除杂质，于50℃下烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过100目筛子获得粒径统一的颗粒，4℃下储存备用。

1.2 不同溶剂提取物的制备

称取荸荠皮粉4 g，置于锥形瓶中。加入100 mL蒸馏水（1∶25，质量体积比）在35℃下提取24 h，过滤后滤渣再以水提取2次，每次1 h。合并滤液，将滤液于真空下浓缩，得浸膏状提取物,记为WE。使用相同的方法分别获得甲醇（80%，体积分数），乙醇（40%，体积分数）和乙酸乙酯总提取物，分别记为ME、EE和EAE。

1.3 提取物清除DPPH自由基能力

移取150μmol/L DPPH溶液1 mL于不同比色管中后分别加入马蹄皮提取物，用蒸馏水补足至5 mL，使反应体系中提取物浓度分别为5、10、20、30、50、70、100、150、200μg/mL，充分混匀，在室温（25℃）下静置30 min后，在波长517 nm处测定其吸光值，记为样品吸光值。同时，以1 mL DPPH溶液与4 mL蒸馏水混合液作为空白，在波长517 nm处测定其吸光值，记为空白吸光值，计算提取物对DPPH自由基的清除率，重复3次，以VC作对照。

1.4 清除羟基自由基能力

参照文献[10]，在6支试管中分别加入浓度均为1.0 mmol/L Fe2+、水杨酸-乙醇溶液各1.0 mL，分别加入1.0 mL质量浓度为0.1、0.3、1、2、3、4、5 mg/mL 的样品溶液，加蒸馏水至5.0 mL，再分别加入1.0 m mol/L H2O21.0 mL，在37℃水浴下反应，60 min后以蒸馏水为参比，于510 nm处测吸光度值。每个试样作3次平行试验，取其平均值。清除率计算公式为:

式中：A0为空白样吸光度；A1为试样吸光度。

1.5 总还原能力

参照文献[11]的方法，在2.5 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同质量浓度的样品液2.5 mL，1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合物在50℃恒温20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/min离心分离10 min，取上层清液5 mL加蒸馏水5 mL和0.1%FeCl3溶液1 mL，在700 nm处测定吸光度。吸光度越高。还原能力越强。试验重复3次。

1.6 薄层层析

称取硅胶G 3 g，置于研钵中，加0.8%羧甲基纤维素钠溶液6 mL，调成均匀的糊状，涂于预先洗净晾干的玻璃板上，迅速振动玻璃板使吸附剂薄层均匀平整，阴干后于烘箱105℃烘0.5 h活化，备用。

在距薄层板一端约1.5 cm处，取少量的总提取物，用毛细管点样于活化好的硅胶板上，将点上样品的薄层板置于装有体积比为8∶1∶1的乙酸乙酯，甲酸，水做展开剂的层析缸中用上行法展开后，用25%的氨水熏蒸显色，并于日光和紫外分析仪下观察，记录，并计算Rf值。

2 结果与讨论

2.1 马蹄皮不同溶剂提取物清除DPPH能力的测定

DPPH自由基是一种以氮为中心、十分稳定的自由基。在与提取物接触时，其氮原子中的孤电子发生配对，导致溶液颜色变浅，吸光度发生变化，从而可以指示提取物对自由基的清除能力。

不同浓度马蹄皮提取物清除DPPH自由基的能力见图1。

图1 马蹄皮提取物对DPPH的清除能力Fig.1 Antioxidant activities of different E.tuberosa extractions as assessed by DPPH method compared with ascorbic acid

由图1可以看出，乙醇提取物对DPPH的清除率最高，在最高浓度下（200μg/mL），提取物清除能力的大小分别为：EE（77.84%）＞WE（55.06%）＞ME（42.34%）＞EAE（27.6%）。马蹄皮提取物具有清除DPPH自由基的能力，随着荸荠皮提取物浓度的增加，其对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，说明马蹄皮提取物对DPPH自由基的清除能力与其浓度存在明显的剂量效应关系。

马蹄皮提取物具有清除DPPH自由基的能力可能与其中含有多酚及黄酮类化合物等多种抗氧化活性成分有关。为进一步确定黄酮的种类，将乙醇提取样液在薄层板上点样，薄层展开显色后，显示样液有2个斑点，呈淡黄色，Rf分别为0.53和0.82。因此可以初步判断马蹄皮乙醇提取物的黄酮成分为2种黄酮类化合物。

2.2 羟自由基清除能力检测

羟自由基是组织细胞中产生的最有代表性的活性氧自由基，其对细胞膜内的氢原子有氧化作用，提取物对羟自由基的清除能力是评价抗氧化能力的重要指标之一。根据Fenton反应的方法建立反应体系模型，水杨酸捕捉·OH产生有色产物，该产物在510 nm波长处有强吸收。若在反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物生成量减少，在510 nm波长处测量各浓度下的吸光度，便可确定提取物对自由基的清除能力，结果见图2。结果表明，马蹄皮乙醇提取物对羟自由基的清除能力最高，在5 mg/mL浓度下，不同提取物的清除顺序依次为EE（83.25%）＞EAE（70.45%）＞ME（60.50%）＞WE（58.82%）。同时在0.1～3.0 mg/mL浓度范围内，随提取物对羟自由基的清除率随浓度的增加而增大。

图2 提取物对羟自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of ETP extraction by various solvents toward hydroxyl radical

从图2可以看出，乙醇和乙酸乙酯提取物对羟基自由基的清除能力强，这表明马蹄皮提取物中的抗氧化成分有较高的极性，含有酚类官能团。另一方面，乙酸乙酯提取物对羟自由基的清除能力（70.45%）大于对DPPH的清除能力（27.6%），说明不同活性成分与自由基的结合方式不同，极性多组分之间可能存在着相互协同的作用，同样的现象用电化学方法在药用植物的研究中也得到了证实[13]。

2.3 总还原能力测定

抗氧化剂可以引起铁氰化物的还原，通过观察在添加马蹄皮不同溶剂提取物后，测定普鲁士蓝在700 nm处吸光度的变化检测样品的还原能力，吸光值越高，表示还原力越强。马蹄皮不同提取物还原能力的大小见图3。

图3 不同提取物总还原能力Fig.3 Reducing power of extracts at different concentrations by spectrophotometric detection of the Fe3+-Fe2+transformation

结果表明：4种提取物均有一定的还原能力，且随着浓度的增加而提高，其还原能力强弱顺序依次为EE>ME>WE>EAE。还原能力的测定结果表明马蹄皮提取物中含有一定数量的还原酮，乙醇对还原酮提取效率较高。

3 结论

利用乙醇、甲醇、水、乙酸乙酯4种溶剂获得马蹄皮提取物。抗氧化性的实验结果表明4种提取物都具有一定的还原能力，对DPPH和羟自由基的清除作用明显，其中乙醇溶剂提取物的对自由基的清除效果最为显著，且该清除效力具有一定的量效关系。薄层层析表明马蹄皮乙醇提取物中含2种黄酮类化合物，且提取物中的不同抗氧化活性组分间可能存在着一定的相互协同作用，共同形成对自由基的清除作用。马蹄皮提取物是一种很好的天然自由基清除剂，这为我们合理开发利用马蹄皮资源和研制安全可靠的食品天然添加剂提供了理论依据，同时后续研究将对活性成分进行分离定性。

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