巴戟天对卵巢切除所致大鼠骨质疏松症的治疗作用及机理探讨＊

王 莹，王少君，潘静华，刘 红，李 艳，付小卫，汪文来，周晟芳，李亚楠，赵红霞，于 峥，赵宏艳，张治国，刘梅洁，Gary Guishan Xiao，鞠大宏△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2.浙江中医药大学，杭州 310053;3.Osteoporosis Research Center，Creighton University，USA)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，POMP)属中医“痹证”、“骨痿”等范畴。中医认为，“肾虚”是导致该病发生的主要原因，临证应以“补肾”为基本大法;而巴戟天具有补肾壮阳之功效，基于此我们以卵巢切除所致的骨质疏松症大鼠为模型，探讨巴戟天对其的治疗作用，并初步探讨其机理，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用雌性清洁级Wistar大鼠60只，体重250g±20g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号 SCXK-(军)2002-001)。大鼠饲养和实验均在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内进行(实验动物室许可证号SYXK(京)-2005-0024)。

1.1.2 药物 巴戟天:购自广东省药材公司中药饮片厂，经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定，为茜草科 (Rubiaceae)茜草属巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。加水煎煮，药液浓缩至1g生药/ml的浓度。

1.1.3 主要试剂 大鼠OPG、RANKL免疫组化一抗:美国Santa cruze;二抗二步法免疫组化检测试剂:北京中杉金桥生物技术有限公司;DAB显色试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司;盐酸四环素:欣惠泽奥科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 Reicheit-Jung2040切片机:德国;OM2563冰冻切片机:美国TBS公司;Qwin图像分析仪系统:德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 先将60只雌性Wistar大鼠随机分为3组:空白对照组12只，假手术组12只和造模组36只。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，摘除双侧卵巢［1］;假手术组只摘取卵巢周围少许脂肪组织。术后1个月，再将造模组大鼠随机分为3组:模型组12只，阳性对照组12只，巴戟天组12只，然后开始给药。巴戟天组灌胃给予浓度为1g生药/ml的水煎剂，阳性对照组灌胃给予0.008mg/ml的己烯雌酚，给药体积均为5.6ml/kg体重。以上灌胃给药3个月，每天1次，连续6d，休息1d，再连续给药6d。空白对照组、假手术组、模型组按上法灌服等体积的蒸馏水。大鼠处死前15d和前3d腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。给药结束后，将各组大鼠迅速脱颈椎处死。取右侧胫骨，用4%多聚甲醛溶液固定，制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学检测;取左侧胫骨用0.01M PBS(PH7.3)配制的4%多聚甲醛溶液固定，制作脱钙的冰冻切片，用于OPG、RANKL蛋白表达的检测。

1.2.2 指标的检测方法 (1)骨组织形态计量学指标的测定:取右侧胫骨近端1/3，除净周围附着的软组织，采用塑料包埋方法，制作不脱钙骨切片;其中一张切片进行甲苯胺蓝染色，另一张切片则直接用于荧光观察。采用Leica Qwin图像分析系统，按章明放等人的方法对不脱钙骨切片进行形态计量［2］。骨小梁组织形态计量:骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比，是衡量骨量水平的主要标志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判断OC的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞(OB)被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比，它可判断OB的活性;骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数。皮质内表面形态计量:类骨质平均宽度(OSW):皮质内表面有OB被覆的类骨质的平均宽度;骨皮质矿化率(mAR):皮质内表面双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数;(2)OB和骨髓基质细胞(MSC)OPG、RANKL蛋白表达的检测:取左侧胫骨近端1/3，按照文献［3］的方法进行标本处理，采用免疫组化法检测OB和MSC OPG、RANKL的蛋白表达。采用Leica Qwin图像分析系统，参照文献［4］方法进行计量。

2 结果

2.1 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响

2.1.1 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨TBV%的影响 表1显示，模型组大鼠胫骨TBV%较假手术组明显降低。巴戟天组TBV%显著高于模型组，但低于假手术组;阳性对照组的TBV%显著高于模型组，而与假手术组比较无显著性差异。

表1 各组大鼠胫骨TBV%的变化

2.1.2 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨TRS%的影响 表2显示，与假手术组相比，模型组大鼠胫骨TRS%显著升高。巴戟天组的TRS%显著低于模型组，而高于假手术组;阳性对照组的TRS%显著低于模型组，而与假手术组比较无显著性差异。

2.1.3 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨TFS%和MAR的影响 表3显示，模型组大鼠胫骨 TFS%、MAR显著高于假手术组。与模型组相比，巴戟天组的TFS%、MAR显著降低，而与假手术组相比明显增高;阳性对照组的TFS%、MAR显著低于模型组，而与假手术组比较无显著性差异。

表2 各组大鼠胫骨TRS%的变化

2.1.4 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨mAR和OSW的影响 表4显示，模型组大鼠胫骨 mAR和OSW皆明显高于假手术组。巴戟天组的 OSW、mAR与模型组比较均无显著性差异;阳性对照组mAR和OSW与模型组比较显著降低，与假手术组比较无显著性差异。

表3 各组大鼠胫骨TFS%和MAR的变化

表4 各组大鼠胫骨mAR和OSW的变化

2.2 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨OB和MSC OPG和RANKL蛋白表达的影响

2.2.1 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白表达的影响 表5显示，模型组大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白表达阳性密度均明显低于假手术组。巴戟天组的阳性密度明显低于假手术组，而与模型组比较无显著性差异;阳性对照组的阳性密度明显高于模型组，而与假手术组比较无显著性差异。

表5 各组大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白表达的变化

2.2.2 巴戟天对去卵巢大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达的影响 表6显示，模型组大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达阳性密度明显高于假手术组。与模型组相比，巴戟天组 OB和 MSC RANKL的阳性密度均明显降低;而与假手术相比，MSC RANKL的阳性密度明显升高，OB RANKL的阳性密度无显著性差异;阳性对照组 OB和 MSC RANKL的阳性密度均明显低于模型组，而与假手术组比较无显著性差异。

表6 各组大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达的变化

3 讨论

本实验结果显示，切除大鼠卵巢后，模型组的骨量主要标志的TBV%显著降低，而代表骨吸收参数的TRS%以及代表骨形成参数的TFS%、MAR、OSW和mAR均显著增高，表明卵巢切除所造成的是一种骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松模型，这与人类绝经后骨质疏松症的发病机理相似。给大鼠灌服3个月的巴戟天后，与模型组比较，巴戟天组的大鼠胫骨 TBV% 显著增加，TRS%、TFS%和 MAR明显降低，OSW和mAR则无显著性差异。这一结果表明，巴戟天对卵巢切除所造成的高转化型骨质疏松症具有一定的治疗作用。

本实验结果亦显示，大鼠切除卵巢后，模型组大鼠胫骨OB、MSC OPG蛋白及其mRNA的表达显著降低，而RANKL蛋白及其mRNA的表达均显著增高。这一结果说明，雌激素缺乏时，OB和MSC OPG蛋白表达减少，RANKL蛋白表达增多，是导致骨质疏松症发生的机理之一。有研究发现，与使用雌激素替代疗法的绝经后女性相比，没有使用雌激素替代疗法的绝经后女性的MSC、B淋巴细胞和T淋巴细胞的RANKL表达是前者的2～3倍;且其RANKL的表达与代表骨吸收的生物学标志物呈正相关，与血清雌二醇的水平呈负相关［5］。Bord等对人类 OB进行体外培养并给予生理剂量的雌激素，发现其OPG的蛋白表达在培养后24h和48h均显著性增高［6］。Ulriki等发现，对绝经后女性给予4个月的雌激素治疗后，其成骨祖细胞的多种细胞周期蛋白表达降低，而钙黏连蛋白表达升高，同时其外周血和骨髓基质中的OPG水平也发生了改变［7］。在本实验中，在给大鼠灌服3个月的巴戟天后，与模型组相比，巴戟天组大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达均显著下调，而OPG蛋白表达无显著性变化。这一结果表明，巴戟天组的作用途径是通过降低RANKL的表达，使 RANKL与RANK的结合减少，从而抑制破骨细胞的成熟与活性，减少骨的过度吸收，进而达到治疗骨质疏松症的作用。

［1］鞠大宏，张春英，王安民，等.温补肾阳方对去卵巢所致骨质疏松症大鼠 IL-1和 IL-6活性的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，张乃鑫，谭郁彬.运动对雌性大鼠去势后骨质疏松症的作用［J］.中华骨科杂志，1994，14(6):365-369.

［3］鞠大宏，于福禄，张丽坤，等.滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠成骨细胞 COX-2蛋白和 mRNA表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12(12):918-920.

［4］贾朝娟，鞠大宏，刘梅洁，等.山药对卵巢切除大鼠骨质疏松症的治疗作用及其机理探讨［J］.中国中医基础医学杂志，2009，15(4):268-271.

［5］Eghbali-Fatourechi G，Khosla S，Sanyal A..Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women［J］.J Clin Invest，2003，111:1221-1230.

［6］Bord S，Ireland DC，Beavan SR，Compston JE.The effects of estrogen on osteoprotegerin， RANKL， and estrogen receptor expression in human osteoblasts［J］.Bone，2003，32:136-141.

［7］Ulrike I，Matthew M，KelleyHoey.Effectsofestrogen on osteoprogenitor cells and cytokines/bone-regulatory factors in postmenopausal women［J］.Bone，2011，49:202-207.